艰难梭菌CysE和CysK蛋白的克隆、表达与生物信息学分析

目的生物信息学分析艰难梭菌半胱氨酸合成蛋白CysE和CysK的理化性质、三维结构和蛋白互作信息,并进行两个蛋白的体外克隆表达和纯化。方法采用ProtParam对CysE和CysK蛋白进行理化性质预测,TMHMM进行跨膜结构域分析,SignalP分析蛋白信号肽,SWISS-MODEL预测二者的三维结构,STRING分析蛋白互作信息。将cysE和cysK目的基因片段分别克隆到pET-32a和pET-28a载体,融合His标签通过大肠埃希菌表达系统来表达目的蛋白,并进行表达纯化测试。结果CysE蛋白共有196氨基酸(AA),无跨膜区,信号肽序列为无,疏水性一般,有2个无序性片段。CysK蛋白共有302 AA,无跨膜区,信号肽序列为无,疏水性一般,有5个无序性片段。两个蛋白共产生α螺旋、β片层、β转角和无规卷曲4种二级结构。CysE的二级结构共由5个α螺旋、15个β片层、10个β转角和19个无规卷曲组成;CysK的二级结构共由15个α螺旋、16个β片层、16个β转角和26个无规卷曲组成。蛋白互作预测结果显示,CysE与CysK涉及菌株的蛋白合成和代谢途径,主要是半胱氨酸的合成途径、甲硫氨酸的合成以及硫代谢途径等。重组表达载体pET-32a-cysE和pET-28a-cysK构建成功,对蛋白诱导表达条件进行优化后,进行SDS-PAGE电泳。结果显示,两个蛋白的分子量分别为CysE 38 ku和CysK 34 ku,二者的纯度大于85%。最终得到的CysE重组蛋白浓度为0.8 mg/mL,CysK重组蛋白的浓度为1 mg/mL。结论本研究对艰难梭菌CysE和CysK的蛋白进行了生物信息学分析,并成功构建和表达了CysE与CysK重组蛋白,为进一步探索二者对于艰难梭菌致病性的相关机制提供了基础。