半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1-骨形态发生蛋白4信号通路对血管紧张素Ⅱ诱导的心室肌细胞肥大的调控作用研究

目的探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(Crim1)是否通过抑制骨形态发生蛋白4(BMP4)而调节血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心室肌细胞肥大。方法分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室肌获心室肌细胞,按干预方式不同分九组:Ad-Null(腺病毒空载体)组、Ad-Null+AngⅡ、Ad-Null+AngⅡ+Nog(重组人头蛋白)组、Ad-Crim1(Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-Crim1+AngⅡ组、Ad-Crim1+AngⅡ+Nog组、Ad-shCrim1(shRNA干扰介导沉默Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-shCrim1+AngⅡ组和Ad-shCrim1+AngⅡ+Nog组。实时荧光定量逆转录PCR检测β-肌球蛋白重链(β-MHC)和BMP4的mRNA表达。Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白BMP4的表达。细胞经结晶紫染色后通过Image J软件测量细胞表面积。结果AngⅡ干预明显增加心室肌细胞β-MHC mRNA表达以及细胞面积,上调BMP4 mRNA/蛋白表达;Ad-Crim1和Nog干预明显抑制AngⅡ的上述效应。Ad-shCrim1干预沉默Crim1基因对心室肌细胞β-MHC mRNA表达,细胞面积及BMP4 mRNA/蛋白表达与AngⅡ干预效应相似,该效应为Nog干预明显抑制。结论Crim1通过下调BMP4的表达而抑制AngⅡ诱导的乳鼠心室肌细胞肥大。

AT1R-Crim1信号通路在乳鼠肥大心室肌细胞Kir2.1mRNA和蛋白表达调控中的作用

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体1型(AT1R)—半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子(Crim1)信号通路在乳鼠肥大心室肌细胞编码内向整流钾电流离子通道的Kir2.1 mRNA和蛋白表达调控中的作用。方法分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室获心室肌细胞,给予腺病毒空载体(Ad-Null)、Crim1基因重组腺病毒载体(Ad-Crim1)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和/或氯沙坦(Los)分组干预。实时荧光定量逆转录PCR检测肌球蛋白重链β(β-MHC)、Kir2.1和Crim1的mRNA表达。Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白Kir2.1和Crim1的表达,细胞结晶紫染色测量表面积。结果AngⅡ干预24 h明显增加心室肌细胞β-MHC的mRNA表达及细胞面积;下调Crim1和Kir2.1的mRNA和蛋白表达。Ad-Crim1和Los干预明显抑制AngⅡ干预的上述效应;Ad-Crim1联合Los较Ad-Crim1单独应用能更显著抑制AngⅡ刺激的上述效应。结论AT1R-Crim1信号通路参与乳鼠肥大心室肌细胞Kir2.1 mRNA和蛋白表达的调控。

富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白2在神经母细胞瘤恶性进展中的功能和机制

目的:探究富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2,CSRP2)在神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)恶性进展中的功能和作用机制。方法:利用R2数据库分析NB临床样本中CSRP2基因的mRNA水平与NB患儿临床预后的相关性;在NB细胞系SK-N-BE(2)和SH-SY5Y中利用靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰CSRP2的表达或利用质粒转染过表达CSRP2;通过结晶紫染色和实时无标记动态细胞分析技术观察NB细胞的增殖情况;采用克隆形成方法观察NB细胞长时间的克隆形成能力;利用免疫荧光实验检测细胞增殖标记物Ki-67的水平;利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色流式细胞术分析细胞周期比例,Annexin V/7AAD染色分析细胞凋亡比例;采用划痕实验观察细胞的迁移能力;利用Western blot或实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测NB原发肿瘤组织和细胞系中蛋白和基因的表达水平。结果:NB临床数据库中,国际神经母细胞瘤分期(international neuroblastoma staging system,INSS)为高危险度3/4期的NB组织中CSRP2的mRNA水平显著高于低危险度的1/2期,且高表达水平组NB患儿的生存期显著低于低表达组;Western blot结果显示,CSRP2在3/4期NB组织中的蛋白水平显著高于1/2期。NB细胞中敲低CSRP2,细胞的活力减弱、增殖能力降低;NB细胞中过表达CSRP2促进细胞增殖;敲低CSRP2后,sub-G1、G0/G1和S期细胞的比例增加,Annexin V阳性细胞的比例增多;敲低CSRP2的NB细胞的划痕愈合率显著小于对照组。机制研究发现,敲低CSRP2后细胞增殖标记分子Ki-67和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2)磷酸化水平显著低于对照组。结论:CSRP2在高危险度3/4期NB组织中高表达,表达水平与NB患儿生存期呈负相关;CSRP2通过促进ERK1/2活化,促进NB细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡,表明CSRP2通过激活ERK1/2促进NB进展,为高危NB的靶向治疗提供了潜在的靶点。

CRIM1在肝细胞癌中的表达及其与上皮-间质转化关系的初步研究

目的 探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(CRIM1)在肝细胞癌(简称肝癌)中的表达及临床意义,初步探讨CRIM1表达水平与上皮细胞-间质转化(EMT)之间的关联性。方法 回顾性分析2013年1月—2017年12月扬州大学附属苏北人民医院收治的114 例肝癌手术患者的临床病理资料,收集患者的术后肝癌组织和对应癌旁组织病理学标本,石蜡切片包埋,并行免疫印迹试验(Western blotting)及免疫组织化学染色检测,观察指标:(1)肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白及EMT相关蛋白(E-钙黏蛋白、波形蛋白)表达情况;(2)肝癌组织中CRIM1蛋白表达与患者临床病理因素的关系。运用Western blotting检测肝癌患者癌组织、癌旁组织中CRIM1及EMT相关蛋白(E-钙黏蛋白、波形蛋白)表达水平情况,采用t检验方法进行灰度值分析;采用免疫组化检测肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白表达情况,根据组化评分将其分为高表达组、低表达组,并用χ2检验和Spearman相关性分析方法分析CRIM1蛋白的不同表达与患者临床病理因素的关系。最后通过Kaplan Meier Plotter数据库分析CRIM1与肝癌患者生存率之间的关联性。 结果 Western blotting显示肝癌组织和癌旁组织中CRIM1蛋白表达灰度值分别为0.15±0.03、0.80±0.04,E-钙黏蛋白表达水平分别为0.20±0.05、0.56±0.06,两者在癌旁组织中表达水平显著高于癌组织(t=14.21、4.69,P<0.05),而波形蛋白在肝癌组织和癌旁组织中表达水平分别为0.74±0.08、0.45±0.06,在癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(t=2.87,P<0.05)。免疫组化进一步验证肝癌组织及癌旁组织中CRIM1表达水平,114 例患者中肝癌组织中,46 例CRIM1蛋白高表达,68 例CRIM1蛋白低表达,CRIM1的表达与患者甲胎蛋白水平、肿瘤大小、有无症状具有关联(r=-0.43、-0.34、-0.24, χ2=9.38、5.25、8.12,P<0.05)。Kaplan Meier Plotter数据库分析表明,CRIM1高表达与低表达两者生存情况差异有统计学意义(P=0.04)。结论 在肝癌中CRIM1的表达与肿瘤EMT过程呈负关联,CRIM1有望成为判断肝癌预后的潜在分子标志物。