表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌杀蚊幼活性及增效剂型测试

目的构建表达蝎毒素AaIT或苏云金杆菌毒素Cyt2Ba的大肠埃希菌,检测重组菌对致倦库蚊和白纹伊蚊II龄幼虫的毒力,并测试不同剂型的增效作用。方法分别将AaIT和Cyt2Ba编码基因克隆于pET28a(+)质粒上,并将重组质粒分别转化BL21 E.coli获得分别表达AaIT和Cyt2Ba的工程菌株,经IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western-blot检测重组蛋白的表达;测试不同浓度工程菌菌液对于蚊幼虫的杀灭效果;并将有效的工程菌制成干粉剂,检测其干粉末及其配剂对蚊幼虫的杀灭效果。结果 AaIT和Cyt2Ba重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,但AaIT重组蛋白对蚊幼虫不具有毒性。表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌菌液对白纹伊蚊和致倦库蚊幼虫均具有明显的杀灭作用,48 h的LC50分别为3.00×106和1.25×107cells/m L,其中对白纹伊蚊幼虫的杀灭效果要显著优于对致倦库蚊幼虫的杀灭效果(P<0.001),并且表达Cyt2Ba重组蛋白的工程菌干粉末及其配剂均具有较好的杀蚊幼虫效果。当该工程菌干粉末与干酵母粉、小麦粉和白胡椒粉分别按4∶1、1∶1和1∶4比例制成配剂处理蚊幼虫48 h后,结果显示当质量比为1:1时,配剂杀蚊幼效果显著提高(P=0.044),并且白胡椒粉末配剂效果要显著好于干酵母粉和小麦粉配剂(P=0.002)。结论表达Cyt2Ba的重组大肠埃希菌对蚊幼虫具有较好的杀灭作用,合适配剂的使用可以增强其在蚊虫防制中的效果。

苏云金芽胞杆菌cyt2Ba16基因的克隆表达

[目的]获得苏云金芽胞杆菌QL32-1中杀虫晶体蛋白基因,并分析其杀虫活性。[方法]采用cyt基因通用引物、两步法染色体步移的方法对QL32-1中cyt基因进行鉴定和全长克隆,再构建重组质粒pET-28a-2Ba16,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,最后对表达蛋白进行杀虫活性分析。[结果]克隆得到1个全长783 bp cyt2B基因,其编码260个氨基酸,推导分子量约29.69 kDa,此氨基酸序列与已知的Cyt2Ba1蛋白同源性最高,为92.4%。该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cyt2Ba16。杀虫活性分析表明:cyt2Ba16对双翅目的库蚊(Culex quinquefasciatus)具有显著的杀虫活性,LC50为9.73μg/mL。[结论]cyt2Ba16基因是一个对库蚊具有较高杀虫活性的新型cyt基因,为QL32-1菌株的应用提供理论基础。