1例异基因造血干细胞移植术后并发CMV和EBV共激活患儿的护理

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)是指将健康人的造血干细胞移植至病人体内,目的是帮助其重建造血和免疫功能。越来越多的研究已经证实allo-HSCT是地中海贫血病人能够重新获得生命的主要治疗方法,目前在各大移植中心广泛开展。

CMV通过影响效应因子MpC002的表达干预桃蚜种群增长的机制

【目的】桃蚜是CMV的重要传毒媒介,效应因子MpC002在桃蚜取食寄主过程中发挥关键作用,CMV和MpC002均存在于蚜虫唾液中,但两者如何相互作用从而利于病毒传播知之甚少。为探讨CMV影响MpC002表达干预桃蚜种群增长的机制。【方法】利用绝对定量的qPCR法建立CMV拷贝数检测的标准曲线方程y=-3.1631x+39.763。【结果】桃蚜取食CMV感染辣椒10 s体内CMV含量最高,然后随着取食时间的延长CMV含量不断降低,其获毒过程符合非持久性传毒特征。取食CMV感染辣椒5 min-24 h的桃蚜MpC002表达量显著降低至取食前的37%-58%;取食CMV感染辣椒的3龄、4龄若蚜和1-4龄若蚜的平均发育历期分别为1.58 d、2.07 d和6.47 d,显著长于取食未处理辣椒的1.25 d、1.47 d和5.33 d,但1龄和2龄若蚜发育历期在CMV感染辣椒和未处理辣椒间无显著差异;平均产蚜期、总产蚜量和单日平均产蚜量分别为10.03 d、16.87头和1.67头,显著短于取食未处理辣椒桃蚜的14.27 d,39.73头和2.82头;净增殖率、内禀增长率、周限增长率分别为16.87、0.21、1.24,均显著低于取食未处理辣椒桃蚜的39.73、0.31、1.36,平均世代周期(13.02 d)和种群加倍时间(3.26 d)均显著长于取食未处理辣椒桃蚜的12.00 d和2.30 d。【结论】CMV能显著抑制桃蚜MpC002的表达,从而延长其发育历期和降低其繁殖,最终抑制其种群的增长。

基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针,并对反应体系进行了优化,建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法,并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示,建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10^(1)、1.25×10^(1)、2.33×10^(1) copies/µL,检测灵敏度比普通PCR法提高10倍;该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY,但烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)无法检出且无交叉反应,批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%,且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点,可为后续TMV、CMV和PVY的病害诊断与流行调查提供技术支持。

基于自然容错开关表的五相永磁同步电机直接转矩控制

五相永磁同步电机(permanent-magnetsynchronous motor,PMSM)传统直接转矩控制(direct torque control,DTC)存在相电流畸变严重、共模电压(common-modevoltage,CMV)高、转矩和磁链脉动大等问题,且无法实现相开路故障情况下的无扰运行。为解决上述问题,提出一种基于自然容错开关表的DTC策略。该策略根据PMSM开路故障前后基电压矢量的特点以及三次平面合成电压矢量为零的原则,构建虚拟矢量(virtual vector,VV),设计故障前后同一套自然容错开关表,进而不但抑制了故障导致的转矩脉动,而且在故障前后均能降低三次谐波电流、减小转矩和磁链脉动、抑制CMV。实验结果验证所提策略的可行性。

双抗TMV+CMV辣椒转基因工程植株的再生及抗病毒鉴定

在构建 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 双价表 达载体和 建立 辣 椒高 效转 化 体系 的基 础 上用 农杆 菌 介导法转化 辣椒栽培 品种农 大４０ 和湘 研一号。 对５２ 个抗 卡那霉 素再生植 株进行点 杂交 鉴定 ，结果 １６株为 Ｔ Ｍ Ｖｃｐ 和 Ｃ Ｍ Ｖｃｐ 阳 性，而 Ｐ Ｃ Ｒ 检测发 现 其中 有 ２ 株 为假 阳性 株。 进一 步 温室 攻毒 试 验 表明有７ 个 阳性转基 因植株 对 Ｔ Ｍ Ｖ 和 Ｃ Ｍ Ｖ 同时表 现为免疫 。

CMV与SP双启动子增强外源基因在小鼠骨骼肌中的表达效率

构建分别含有CMV、肌肉特异启动子SP及双启动子CMV-SP的真核报告基因EGFP表达载体(pCMV-EGFP、pSP-EGFP及pCMV-SP-EGFP)和生长激素释放因子(GRF)表达载体(pCMV-GRF、pSP-GRF和pCMV-SP-GRF).将3种EGFP表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌.注射后1周、2周、3周以及4周时,分别提取肌肉组织RNA,应用半定量RT-PCR检测报告基因(EGFP)的表达量,发现pCMV-SP-EGFP组EGFP表达量显著高于pCMV-EGFP组和pSP-EGFP组(P<0.01);经荧光检测得到了较强的荧光信号.将3种GRF表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌,在注射后每隔10d记录小鼠累积增重,采血并用RIA法测定血清胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)浓度,结果pCMV-SP-GRF组累积增重、IGF-I浓度分别高于生理盐水组、pCMV-GRF组和pSP-GRF组(P<0.05).结果表明:CMV与SP两种启动子组合,在小鼠骨骼肌内使外源基因表达效率提高.本研究为提高外源基因在肌肉组织的表达提供了新的途径.

海藻提取物防治番茄CMV病毒效果及其机理研究

探讨了海藻提取物对番茄CMV病毒的防治作用,结果表明:海藻提取物对CMV有很好的体外钝化效果和预防CMV侵染的作用,其中以3.0g.L-1的浓度较为合理;番茄接种CMV病毒后施用海藻提取物,病株的SOD、POD酶活性明显升高,并明显降低了病株的病毒含量,降低了病毒对叶绿体的破坏。

烤烟CMV抗性基因QTL定位

利用SSR技术,在抗CMV烟草中发掘与抗病基因紧密连锁的分子标记,目的是为抗病基因的定位克隆以及培育抗病新品种奠定基础。本研究以抗CMV的烤烟品种台烟8号、感病品种NC82为亲本,构建BC1代分离群体,对其进行抗性遗传分析。对分布于烟草24条连锁群上的2317个SSR位点进行了多态性筛选,获得了62个稳定多态性标记,利用这些标记对288株BC1群体分型数据,用WinQTLCart2.5进行分析,找到一个与抗性相关的QTL,LOD值为2.6。研究结论表明,台烟8号对CMV的抗性由多基因控制,标记53735与抗性QTL紧密连锁,遗传距离为0.1 cM,该QTL位于10号连锁群,贡献率为13%。

我国不同CMV分离物2b基因片段的RT-PCR扩增及其序列比较

本研究根据黄瓜花叶病毒2b基因的保守序列设计引物,利用一步RT-PCR技术对多个不同寄主和不同地理来源的黄瓜花叶病毒分离物的2b基因片段进行扩增,获得了含该基因全长约90％的cDNA片段(300bp)。序列测定与比较分析结果表明,国内不同CMV分离物2b基因片段核酸序列同源性达93％以上,推测的氨基酸序列同源性超过90％,且均属于亚组Ⅰ。

CP基因转化的线辣椒抗卡那霉素和抗CMV特性的遗传

利用根癌土壤杆菌 ,采用叶盘法转化线辣椒 (Capsicum annuum var.longunt)优良品种陕 82 12 ,建成了能同时表达 CMV和 TMV外壳蛋白基因 (CP基因 )的 T1 代纯合系。以其自交 T2 ～ T4代 ,以及 T2 代植株与未转化陕 82 12杂交的 F1 代和 F2 代群体为试材 ,研究了抗卡那霉素和抗黄瓜花叶病毒 (CMV)特性的遗传传递规律。结果发现 ,抗卡那霉素标记基因和抗病性基因在自交和杂交各代都能稳定地高效表达 ;两者在自交各代纯合 ;在杂交 F1 代抗药性和抗病性都表现为显性 ;在杂交 F2 代 ,抗药植株对敏感植株 ,以及抗病植株对感病植株的分离比都符合 3∶ 1的理论比例。

CMV侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达及代谢响应的研究

【目的】研究黄瓜花叶病毒病(CMV)侵染胁迫下黄瓜重要功能基因表达和代谢途径响应。【方法】在结合气体交换和叶绿素荧光参数及抗性相关酶活性测定的基础上,应用农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室自主开发的黄瓜cDNA芯片研究黄瓜在CMV侵染胁迫下的基因表达谱变化,并对其中5个具有代表性的基因通过实时荧光定量PCR(QRT—PCR)进行检测,以验证cDNA芯片杂交结果的可靠性。【结果】共获得67个差异表达显著的基因,其中42个基因下调表达,25个基因上调表达。这些差异表达的基因涉及了许多重要代谢途径。许多与光合作用、氮同化相关的基因受到明显的抑制;而一些防御相关基因和信号传导相关基因则诱导表达;同时,也发现了一些与CMV胁迫相关的功能未知基因或未有任何功能信息的基因。【结论】CMV胁迫引发了黄瓜代谢发生一系列复杂的适应性变化,PR1-1a等基因可能在黄瓜防御CMV侵染过程发挥着重要作用。

烤烟CMV抗性的主基因+多基因混合遗传模型分析

以高抗CMV的烤烟品种台烟8号为母本(P1),以高感CMV的烤烟品种NC82为父本(P2),在2个不同的时间环境下构建P1、P2、F1和F24个世代群体,在植株不同生长时期进行CMV病害鉴定。运用植物数量性状"主基因+多基因"混合遗传模型分析方法对该世代群体的CMV抗性进行联合分析。结果表明,在温室环境中,苗期和成株期鉴定CMV抗性遗传都符合E1模型,即由2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性多基因混合控制,主基因遗传率分别是37.11%、57.76%;在大田环境中,苗期抗性鉴定符合加性-显性-上位性多基因模型(C0),多基因遗传率为26.86%,而成株期鉴定属于2对主基因+多基因模型(E2),主基因遗传率为36.57%。研究表明,由于植物抗性基因的表达具有时空性,台烟8号对CMV的抗性遗传在不同的时间和环境具有一定的差异;但随着植株的生长,抗性遗传趋于稳定,在成株期时,2个不同的环境均表现为2对主基因+多基因控制,所以对烤烟CMV抗性品种选育和改良要以主基因为主,同时注重环境的影响。

转化CMV－cP基因番茄对CMV病毒抗性鉴定

苗期人工接种，对转化ＣＭＶ－ｃＰ基因的番茄品种８８０５Ｒ１～Ｒ４代进行接种ＣＭＶ病毒试验。结果表明：黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因在番茄中的表达，对抑制ＣＭＶ病毒病症状的表现及延迟其发展均起到一定作用。８８０５Ｒ３代对ＣＭＶ的抗性明显高于Ｒ１代，Ｒ４代抗性已基本稳定。当高浓度的ＣＭＶ病毒侵染Ｒ４代植株时，也会出现１００％的发病率，但它们的新生枝叶能正常生长并开花结果。利用半叶法测定８８０５Ｒ。（ｃｐ＋）及８８０５Ｒ４（ｃｐ－）接种叶和新生叶病毒浓度，结果是：ｃｐ（＋）和ｃＰ（－）在接种叶上病毒含量相当，但ｃＰ（＋）的新生叶中病毒含量明显低于ｃＰ（＋）的等位叶，说明ＣＭＶ－ｃＰ基因的存在，限制了ＣＭＶ病毒粒子的迁移和繁衍，最终也减轻了ＣＭＶ病毒的危害程度。

肾移植患者CMV医院感染途径研究

目的为明确肾移植受者术后ＣＭＶ医院感染的途径。方法用ＥＬＩＳＡ法对２１份供者及相应４１名受者（Ａ组）１３９份血标本作ＣＭＶＩｇＧ、ＩｇＭ测定；并与同期住院的２１位既往肾移植受者（Ｂ组）结果进行比较。结果供者ＩｇＧ、ＩｇＭ阳性率分别为９０．５％和０；Ａ组术前、术后１月内ＩｇＧ、ＩｇＭ阳性率分别为９２．７％、９．８％及９６％、９．２％。Ｂ组患者ＩｇＧ、ＩｇＭ阳性率分别为１００％及７１．４％，其ＩｇＧ滴度及ＩｇＧ、ＩｇＭ阳性率均高于Ａ组结果（Ｐ均＜０．０１）。结论肾移植受者术前ＣＭＶＩｇＧ阳性率很高，由供者→受者所造成的原发感染比重很小，而继发性感染可能是重要的医院感染途径。

加工番茄CMV与ToMV的ELISA检测及其相关性分析

用针对CMV和ToMV的单克隆抗体对田间表现病毒病症状的137个加工番茄自然病株进行了间接ELISA检测,检测结果表明,CMV和ToMV在加工番茄上的侵染率分别为83.2%和61.3%,并且2种病毒常复合侵染,复合侵染率达58.4%。用Eviews3.0软件借助加权最小二乘法(WLS)分析CMV和ToMV在病株上的带毒量,结果表明,2种病毒在病株上的积累是相互影响的,互为正相关关系。

转CP基因线辣椒对CMV和CMV-RNA的抗病性比较

本试验以转化 CMV- CP和 TMV- CP基因线辣椒纯合系作试材 ,比较了接种 CMV粒体和CMV- RNA后的发病特点和叶片中的病毒含量。结果表明 :转化线辣椒不仅能抵抗 CMV粒体的侵染 ,而且还能抵抗 CMV- RNA的侵染。不论接种 CMV粒体或 CMV- RNA,CP(+ )线辣椒的系统症状都延迟出现 ,显症株率和病害严重度级别大幅度降低 ,病毒增殖和运转受到抑制 ,接种叶片与新生叶片中的病毒含量明显减低。这一结果证实 CMV- RNA不能克服线辣椒由 CP基因介导的抗病性。

基于SLAF-seq技术的烟草抗CMV主效QTL定位

烟草花叶病(CMV)是烟草主要病害之一,筛选与CMV抗病QTL紧密连锁的分子标记是烟草抗病分子育种的重要部分。本研究以抗病材料台烟8号和感病材料NC82为亲本,获得BC1群体,构建抗、感池。采用BSA和SLAF-seq技术开发CMV抗病相关SNP分子标记,共获得180 370个SLAF标签,经分析后获得6156个多态性SNP标记。利用SNP-index分析方法,发现两个与CMV抗病高度关联的区域。利用这些分子标记成功定位到了两个CMV抗病相关QTL,其中一个QTL定位于Chr01上的55.72～60.44 Mb区间内,区间大小为4.72 Mb;另一个则定位于烟草Chr18上的44.21～48.70 Mb区间内,区间大小为4.49 Mb。在关联到的QTL区间内设计分子标记可以用于烟草抗CMV育种的辅助选择。

应用点免疫结合法和组织印迹法检测烟草组织中的TMV和CMV

报道了应用酶联免疫测定法中的点免疫结合法 (Dot immunoblots ,Dot ELISA)和组织印迹法(Tissueblots ELISA)检测烟草组织中烟草花叶病毒 (TMV)和黄瓜花叶病毒 (CMV)的方法及效果。Dot ELISA检测提纯TMV ,兔抗TMV血清稀释 10 0 0倍 ,最低检出率可达 1.2 5ng/ml;检测TMV病叶汁液 ,最低检出稀释度为 1∶2 560。检测CMV病叶汁液 ,兔抗CMV血清稀释 50 0倍 ,最低检出稀释度为 1∶2 560。Dot ELISA检测低稀释度健康烟叶粗汁液时存在假阳性 ,提高稀释度可消除假阳性。应用Dot ELISA ,选择反应强度高、健康烟叶粗汁液无假阳性的抗血清稀释 10 0 0倍 (TMV)、50 0倍 (CMV) ,样品粗汁液稀释30 0倍 ,以及应用组织印迹法对采自云南曲靖市的花叶样品进行了TMV和CMV检测 ,并与电镜负染法的检测结果验证。表明两种方法都可以用来检测烟叶样品。组织印迹法比Dot ELISA法的操作简单 ,灵敏度高 。

WRKY转录因子在烟草受CMV侵染和激素处理中的表达模式初步分析

WRKY转录因子在调控植物抵抗病原菌的侵染中发挥重要作用,但是,目前为止还没有WRKY转录因子在烟草抗CMV中调控机理的研究。本研究检测了感病品种‘K326’和抗病品种‘TT8’在接种CMV后其WRKY1、WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达情况。结果显示,CMV侵染后‘TT8’中4个WRKY转录因子表达量均有大幅上升;而‘K326’中WRKY2、WRKY4和WRKY11的表达量与CMV侵染前无显著差异,WRKY1表达量则大幅下降。幼苗经外源激素(水杨酸、茉莉素、乙烯)处理后用RT-PCR检测,结果表明,‘K326’和‘TT8’中WRKY转录因子对外源激素的诱导响应比较复杂多样,但总体表现为在‘TT8’中WRKY1、WRKY2和WRKY4会受到乙烯和茉莉酸的诱导,但在‘K326’中转录因子的表达未受明显诱导。