金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的培养性状和营养体亲和性

金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)是一类重要的树木腐烂病菌,其培养性状和真菌菌丝的营养体亲和性能够反映真菌的遗传、形态、生理、病理和生态等方面的差异。为了探讨金黄壳囊孢菌的遗传变异和遗传多样性,研究对采自我国9个省份的12个杨树品种上的30株C.chrysosperma在4种培养基中的培养性状进行了观察,并在PDA培养基上进行了真菌的营养体亲和性试验。结果表明,供试金黄壳囊孢菌在培养性状上存在明显的种群分化,通过模糊聚类可将30个菌株划分为8个组,且其亲缘关系的远近与地理来源有明显的相关性;30个菌株在PDA上的亲和性配对试验结果表明,绝大多数菌株间产生黑色色素带,少数菌株以及同一菌株不同菌落间不产生此色素带,30个菌株归为25个营养体亲和群(VCG),其中21个VCG各只含1个菌株,1个VCG含3个菌株,只有3个VCG各含2个菌株。研究结果说明供试菌株的营养体亲和性与其地理来源无明显相关性。

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。

西宁市杨树腐烂病病原菌分离及杨树腐烂病菌的寄主范围和药剂敏感性测定

对采自青海西宁市新疆杨(Populus alba var.pyramidalis)上的杨树腐烂病样品进行病原菌分离、致病性测定和病原鉴定。利用离体枝条接种法测定分离自青海(Cytospora chrysosperma QHYSFL6~8)和内蒙古呼和浩特(Cryptosphaeria pullmanensis YSFL1、Cytospora chrysosperma YSFL3、C.chrysosperma YSFL4-2)共6株杨树腐烂病菌对大紫李(Prunus salicina)、串枝红杏(P.armeniaca cv.Chuanzhihong)、金红苹果(Malus pumila cv.Jinhong)、海棠(M.spectabilis)和中华枸杞(Lycium chinense)枝条的致病性,并利用菌丝生长速率法测定其对苯醚甲环唑、腈菌唑、吡唑醚菌酯、戊唑醇、咪鲜胺和多菌灵共6种化学药剂的敏感性。试验结果表明:从青海省西宁市感病的新疆杨上分离到3株致病菌,将其命名为QHYSFL6、QHYSFL7、QHYSFL8,形态学结合内转录间隔区(ITS)与β微管蛋白基因序列确定3株菌均为C.chrysosperma。供试的6株病原菌均可侵染大紫李和串枝红杏,但不能侵染金红苹果、海棠和中华枸杞。不同杨树腐烂病菌对待测药剂的敏感性差异明显,6种待测化学药剂对供试菌株均表现出一定的抑制活性,其中,苯醚甲环唑对6种病菌的抑制效果最好,EC_(50)值为1.1348×10^(-5)~6.4400×10^(-4)mg/L,可作为两地杨树腐烂病防治的首选药剂。

木霉菌对杨树树皮溃疡病菌拮抗作用的研究

应用哈茨木霉 (Trichodemaharzianum )T88菌株和深绿木霉 (T .atroviride)T95菌株分别与杨树烂皮病菌 (Cytosporachrysosperma)和杨树水泡溃疡病菌 (Dothiorellagregaria)进行了平皿对峙培养和载片对峙培养 ;并研究了两种木霉菌产生的挥发性代谢物对病原菌菌落的影响和其非挥发性代谢物对菌丝干重的影响 ;分别在光学显微镜和扫描电镜下观察了两种木霉菌的重寄生现象。结果表明 :对峙培养中木霉菌T88和T95对两种病原菌均有明显的抑制作用。两种木霉菌均能产生挥发性代谢物质并不同程度地抑制病菌菌落的生长 ,在密闭条件下T95的抑制率最高达到 80 .30 %。两种木霉菌产生的非挥发性代谢物质可以强烈抑制病原菌的生长、明显降低其菌丝干重 ,并具有热稳定性。在光学显微镜和扫描电镜下 ,可以观察到木霉菌的菌丝在病原菌的菌丝上平行或波浪式生长 ,并在其上产生钩状分枝、吸器或附着胞吸附于病原菌的菌丝上 ,或穿透病原菌的菌丝生长 。

内蒙古呼和浩特市杨树腐烂病病原菌鉴定

为明确内蒙古呼和浩特市引起杨树腐烂病的病原菌种类,利用组织分离法对内蒙古呼和浩特市杨树腐烂病菌进行分离,基于柯赫氏法则对其致病性进行测定,采用形态学结合分子生物学方法,对病原菌进行鉴定。结果表明,从内蒙古呼和浩特市表现树皮腐烂症状的杨树上分离到8株真菌,其中3株可以回接到杨树枝条并引起典型的杨树腐烂病症状,将其命名为YSFL1、YSFL3和YSFL4-2。根据菌落特征、产孢体形态及ITS、β-tubulin序列将其确定为Cryptosphaeria pullmanensis(YSFL1)与Cytospora chrysosperma(YSFL3、YSFL4-2)。C.pullmanensis与C.chrysosperma可以引起内蒙古呼和浩特市地区的杨树腐烂病。结果可为开展内蒙古地区杨树腐烂病的防治和病原菌的鉴别研究奠定基础。

木霉菌株对金黄壳囊孢菌的抑菌效应及机制

采用对峙培养法和生长速率法,从29个木霉菌株中筛选出3株对金黄壳囊孢菌具有显著抑制效果的菌株T-33,T-14,T-09,并对3个菌株的抑菌活性成分进行复筛确定T-33菌株培养液的正丁醇浸提物对金黄壳囊孢菌菌丝生长的抑制率最高,达到94%,并能显著抑制分生孢子萌发。该抑菌活性成分可显著提高金黄壳囊孢菌细胞膜的通透性,降低病原菌蛋白质含量和SDH,PK,HK,LDH,MDH与辅酶Ⅰ的活力,同时导致Na+,K+-ATP酶,Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性急剧下降。结果表明:金黄壳囊孢菌细胞膜脂质过氧化严重,糖酵解途径、TCA循环、电子传递与氧化磷酸化过程等代谢途径均不能正常进行,产能下降。抑菌活性成分通过破坏病原菌的防护系统和代谢途径抑制其生长。

新疆南疆核桃树腐烂病菌鉴定

【目的】明确新疆南疆核桃腐烂病菌种类。【方法】从南疆3个地方采集核桃腐烂病样10份,采用组织分离法分离获得10个分离物,根据科赫氏法则进行致病性测定,结合形态学观察和18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析。【结果】经形态学特征鉴定,菌落形态、分生孢子器、分生孢子与已报道的金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma一致;从18 S rDNA-ITS、β-tubulin两个基因序列分析可以得出,18 S r DNA-ITS序列分析结果与C.chrysosperma(登录号:KP114125.1)相似性为99%,β-tubulin序列分析结果与C.chrysosperma(登录号:KP117038.1)相似性达到98%。【结论】新疆南疆核桃树腐烂病菌为金黄壳囊孢C.chrysosperma。

新疆核桃树腐烂病拮抗细菌的筛选及初步鉴定

【目的】核桃腐烂病已成为制约新疆核桃产业健康发展的重要病害之一,筛选拮抗菌株开展该病害的生物防治,有利于新疆生态健康果园的建设。【方法】采用平板分离、对峙培养、致畸菌丝形态观察、拮抗菌形态学、生理生化特性及分子生物学的鉴定方法。【结果】获得具有广谱拮抗效果的拮抗菌株XJAU-117,对核桃树腐烂病病原菌的拮抗效果达85%。通过形态学观察、生理生化特性和16s r DNA序列分析,鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),拮抗菌株对核桃树腐烂病病原菌的抑制机理主要为使正常菌丝发生断裂、解体,无法正常生长。【结论】所获得的拮抗细菌对核桃树腐烂病病原菌表现出较好的拮抗作用,对生物防治核桃树腐烂病具有潜在的应用价值。

Amanita virosa对杨树烂皮病的抑制效果及其抑菌机理初探

将Amanita virosa用于杨树烂皮病的防治研究,依次做了A.virosa与病原菌Cytospora chryso-sperma的拮抗试验、A.virosa粗提液对C.chrysosperma的菌丝体及其孢子的抑制试验以及粗提液对杨树烂皮病病斑的抑制试验,结果表明对杨树烂皮病起主要抑制或预防作用的是A.virosa粗分离物Ⅳ;C.chrysosperma菌丝体的己糖激酶活力降低,丙酮酸激酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和ATP酶活力提高,呼吸作用加快,产生大量的活性氧自由基,而且丙酮酸激酶活力和乳酸脱氢酶的活力提高使无氧呼吸加快,病原菌进行大量的无氧呼吸表现为缺氧;过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总超氧岐化酶的含量都极低,不能及时清除呼吸作用急剧加快产生的活性氧自由基,对体内生物分子产生损伤作用,随着A.virosa培养粗提液浓度的增加受影响程度加大。

黄绿木霉菌代谢产物对杨树烂皮病菌抑菌能力的研究

该文利用室内实验的方法,研究了黄绿木霉菌代谢产物对杨树烂皮病菌的抑菌能力.黄绿木霉菌代谢产物在经121℃处理25min后,50%浓度下抑菌作用可高达100%.在pH为3～9范围内该代谢产物的抑菌能力变化不大,说明pH变化对其活性没有影响.在对黄绿木霉菌发酵过程中,利用马铃薯葡萄糖(PD)培养基即可达到有效的抑制杨树烂皮病金黄壳囊孢菌菌丝生长的目的,而且利用马铃薯葡萄糖(PD)培养基发酵3～4d的黄绿木霉菌代谢产物抑菌效果最好,抑菌中浓度最低,发酵时间过长与过短,均不利于对病原菌的抑制.经黄绿木霉菌代谢产物处理的菌丝电导率与呼吸强度均发生变化,在光学显微镜与透射电镜下观察到病原菌菌丝体发生变化,细胞壁有所改变.

塔里木河下游胡杨树腐烂病病原鉴定

对新疆塔里木河下游胡杨树Populus euphratica腐烂病病原菌进行分离和鉴定。从新疆巴音郭楞蒙古自治州铁门关市采集胡杨树腐烂病典型病样12份,采用组织分离法分离获得12个分离物,根据科赫氏法则测定致病性,结合形态学观察和18S r DNA-ITS,β-tubulin两个基因序列分析,将其鉴定为金黄壳囊孢Cytospora chrysosperma。

四种毒蘑菇菌株及其毒素对杨树烂皮病菌生长的抑制作用

该文研究了鳞柄白鹅膏、毒蝇鹅膏菌、细鳞环柄菇及绒白乳菇 4种毒蘑菇菌株及毒素对杨树烂皮病菌菌丝生长及孢子萌发的影响 ,结果表明 :鳞柄白鹅膏和细鳞环柄菇对杨树烂皮病菌有一定的拮抗作用 .鳞柄白鹅膏拮抗效果最好 ,在室内对峙培养试验中 ,杨树烂皮病菌菌株对鳞柄白鹅膏菌株的生长不但没有抑制作用 ,反而促进其生长 ,促生长效果在 74h达最高 ,而此时杨树烂皮病菌菌株被鳞柄白鹅膏菌株的抑制也达最高 ;绒白乳菇菌株对杨树烂皮病菌菌株的生长不但没有拮抗作用 ,反而促进其生长 .4个毒蘑菇菌株的毒素粗提液对病原菌株菌丝生长抑制率均达 10 0 % ,对孢子萌发的抑制率为 93 36 %～ 97 2 9% .

哈茨木霉分生孢子提取物对杨树烂皮病菌、水稻稻瘟病菌的抑制作用

运用甲醇、乙醇、NaOH、超声波4种方法对哈茨木霉分生孢子进行提取,并将提取物分别对杨树烂皮病菌、水稻稻瘟病菌进行了抑菌试验。对杨树烂皮病菌的抑菌试验结果表明:超声波水法中D1提取物稀释100倍的抑菌率最高,为43.42%;3种超声波水法提取物抑菌率的方差分析表明,各处理差异显著;将NaOH提取物稀释100倍后抑菌率为39.46%,而甲醇和乙醇的提取物的抑菌效果较弱,分别为10.60%和13.44%。对水稻稻瘟病菌1号、2号菌株的抑菌试验表明:D1提取物稀释100倍的抑菌率均较高,分别为42.18%和31.99%;将甲醇提取物稀释100倍后对1号菌株的抑菌率为35.78%;将乙醇提取物稀释100倍后,对2号菌株的抑菌率为18.52%。

长枝木霉菌株T05抑菌活性与拮抗机制

研究了长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)菌株T05的抑菌活性与拮抗机制,包括菌落的对峙培养试验,挥发性物质和4种分生孢子提取物的抑菌试验。对峙培养试验表明,T05对灰霉病菌(灰葡萄孢(Botrytis cinerea))和杨树烂皮病菌(污黑腐皮壳(Valsa sordida))均表现出很强的抑菌活性,抑菌率分别高达88.4%和91.9%;其产生的挥发性物质对B.cinerea有较强的抑菌活性,抑菌率高达91.9%,而对V.sordida抑菌作用较弱,最高为37.2%;甲醇、乙醇、Na OH、超声波破碎水抽提4种分生孢子提取物对V.sordida的抑菌试验表明,Na OH提取物100倍液的抑菌率最高,为76.3%,而甲醇和乙醇提取物的抑菌效果稍弱,超声波水法的提取物仅对病菌有微弱的抑制作用。

吉林省主要栽培杨树品种烂皮病的发生及其管理技术

于2002-2006年,对吉林省现行推广的杨树品种烂皮病的发生原因、发病规律及抗性差异进行调查,在此基础上进行防治试验。结果表明,在各品种的适生区域内,晚花杨(Populus×eurameicana‘Serotina’)、格尔里杨(Populus×curameicana‘Gelrica’)、西+加杨(Populus suaveolens+P.canadensis)、黄快杨(Populus simonii×P.pyramidalis‘Huangkuai’)、白林2号杨(Populus‘Bailin-2’)及中延1号杨(Populus‘Zhongyan’)高度抗病;中绥12号杨(Populus deltoides×P.cathayana‘Zhongsui-12’)、大青杨优良无性系(Populus ussuriensis‘Jilin’)较抗病;大青杨(Populus ussuriensis)、银中杨(Populus alba×P.berolinensis)中度感病;迎春5号杨(Populus nigra×P.simonii‘Zhonglin Sanbei-1’)、北京杨(Populus pyramidalis×P.cathayana)、小×黑杨(Populus pseudo-simo-nii×Populus nigra)、吉林杨(山地1号)(Populus deltoids‘Jilinsis’)、长林1号杨(Populus×beijingensis‘Chang-lin-1’)欧美杨107(Populus×euramericana‘Neva’)、欧美杨108(Populus×euramericana‘Guariento’)易感病。对发病率在50%以上的造林地,应采用苗木平茬处理措施;当杨树幼林地苗木发病率在50%以下时,以21%过氧乙酸水剂(1∶10)、10%混合氨基酸铜络合物(1∶10)和50%多菌灵(1∶25)涂干防治可取得较好效果。其中以21%过氧乙酸水剂(1∶10)防治效果最好,为82%～95%。

金黄壳囊孢菌rDNA ITS序列测定及生理学特性

通过在实验室内培养杨树烂皮病菌金黄壳囊孢菌菌株CC1,确定了其孢子萌发有一定的物候期,产孢规律与自然条件下杨树烂皮病的发病季节一致,其菌丝生长不随季节的变化而变化。菌株CC1的生长最适温度30℃,最适pH值为5～6,最适碳氮源分别是葡萄糖和蛋白胨。最适培养基配方:马铃薯200g,蔗糖20g,酵母膏2g,蛋白胨2g,硫酸镁0.5g,磷酸二氢钾1.5g,维生素B1100mg,琼脂20g,水1000mL。对菌株CC1进行ITS序列的测定,结果显示菌株的ITS序列长度为907bp,GenBank登录号为EF101159,从分子生物学的角度确认了试验菌株CC1为Cytospora chrysosperma。

不同来源金黄壳囊孢菌的培养性状及对3个品种杨树的致病性研究

为明确从新疆吐鲁番、喀什、巴音郭楞蒙古自治州、哈密、塔城、五家渠的杨树(Populus spp.)、柳树(Salix spp.)、苹果树(Malus spp.)、榆树(Ulmus spp.)、红瑞木(Swida spp.)5种寄主上金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)的培养性状及致病性差异。本研究采用单孢分离法获得纯化菌株,通过ITS基因片段结合形态学特征筛选得到金黄壳囊孢菌;观察菌株在PDA培养基上的颜色、形态、产生子实体的情况划分形态学类型;将具有不同类型的金黄壳囊孢菌通过烫伤法接种至银白杨(Populus alba)、新疆杨(P.alba var. pyramidalis)、毛白杨(P.tomentosa)的离体枝条上,通过测量病斑扩展面积,分析不同类型菌株的致病能力。结果表明,从新疆吐鲁番、喀什、巴音郭楞蒙古自治州、哈密、塔城、五家渠等地的5种寄主上共收集到金黄壳囊孢属真菌47株;通过培养特征划分出15种形态学类型;不同类型的菌株均能成功侵染3个品种杨树的离体枝条且致病性呈现一定差异,其中采自塔城,菌落特征为白色、无子实体产生的菌株XJAU 935的致病力最强,在银白杨上形成的病斑面积达146.91 cm2;该菌株接种至3个品种杨树的枝条上后3~6 d开始发病,病菌在第10天至第14天和第22天至第26天出现两次扩展高峰,接种26 d后不再扩展。

7种杀菌剂对杨树烂皮病、溃疡病病菌的室内毒力测定

室内测定了7种杀菌剂对杨树烂皮病病原菌金黄壳囊孢菌Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.、溃疡病病原菌Dothiorella gregaria Sacc.的毒力。72 h含药平板对抑制金黄壳囊孢菌的菌丝生长毒力最强的有10%苯醚甲环唑水分散剂、250 g/L嘧菌酯悬浮剂,EC50值依次为0.000 6,0.020 2μg/mL;其次为70%甲基托布津可湿性粉剂,EC50为0.195 8μg/mL;最弱的是树乐粉剂,EC50为319.658 0μg/mL。48 h对杨树溃疡病病原菌的毒力最强的有250 g/L嘧菌酯悬浮剂、10%苯醚甲环唑水分散剂,EC50依次为0.072 2,0.090 4μg/mL;其次为70%甲基托布津和50%多菌灵可湿性粉剂,EC50依次为2.5603,19.0454μg/mL;树乐最弱,EC50为366.415 7μg/mL。同一药剂对杨树烂皮病菌的毒力强于溃疡病菌。

中国金黄壳囊孢菌的致病性分化及遗传多样性

对来源于国内11省(区)31市(县)的46株金黄壳囊孢菌进行致病性和遗传多样性聚类分析。结果表明:金黄壳囊孢菌的致病性与地理来源无明显关系而与寄主种类有一定的关系,从杨树上分离菌株的致病性强于非杨树上分离的菌株。RAPD分析表明:所有来源的46个菌株可分为2大类群,第1类群包括北京、新疆、辽宁、陕西、吉林、青海、甘肃的全部菌株和黑龙江5个菌株、山东2个菌株、内蒙古1个菌株,第2类群包括四川的全部菌株、内蒙古7个菌株和山东1个菌株。第1类群又可分为北京类群、新疆类群、辽宁类群、甘肃青海混合类群和黑吉青陕甘混合类群5个类群,第2类群可分为内蒙古类群和四川类群2个类群。金黄壳囊孢菌遗传多样性分组与菌株的地理来源呈较明显的相关性。

短柄樱桃干腐病病原菌的鉴定及其生物学特性

为了明确短柄樱桃干腐病的病源,采用组织分离法和单孢分离法分离纯化了病原菌,依据柯赫法则、形态特征及核糖体基因内转录间隔区(r DNA-ITS)序列对其进行了鉴定,同时检测了其部分生物学特性.实验结果表明:引起短柄樱桃干腐病的病原菌为金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma;KR260904);该病菌菌落生长和孢子萌发的最适p H为9,最佳光照条件为12 h黑暗/12 h光照,最适温度为25℃;在供试的10种碳、氮源中,乳糖和蛋白胨利于该菌落的生长,葡萄糖和酵母有利于其孢子的萌发.