2型猪链球菌gene0969基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33毒力岛89K上的Ⅳ型分泌系统组分gene0969敲除突变体,初步分析其活性,为进一步研究猪链球菌假想毒力因子在致病中的作用提供实验基础。方法:以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增gene0969基因的上下游片段;以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm;采用重叠PCR方法搭建3个片段,并克隆到自杀载体pSET4s上,构建基因敲除载体,通过同源重组构建gene0969突变体,再用小鼠感染模型对突变株和野生株的毒力进行比较。结果:获得了gene0969基因敲除突变体,并发现其毒力与野生型相比有下降趋势。结论:2型猪链球菌假想毒力因子gene0969可能与毒力有关,其作用和机制值得进一步分析。

LIPI-4 EⅡC调控单增李斯特菌关键毒力因子转录的研究

【目的】探究单增李斯特菌(LM)毒力岛4(LIPI-4)中膜透性酶ⅡC(EⅡC)对LM关键毒力基因表达的影响。【方法】构建分离株LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC,测定各菌株的生长曲线和对不同糖的发酵情况,测定侵染人脑微血管内皮细胞(HCMEC/D3)后的黏附、侵袭和胞内增殖能力,利用实时荧光定量PCR方法检测在脑心浸液(BHI)培养条件下和侵染HCMEC/D3后各菌株毒力基因的转录水平。【结果】成功构建LM928 EⅡC基因缺失株LM928ΔEⅡC和回补菌株CLM928ΔEⅡC。EⅡC基因的缺失不影响LM928的生长和对葡萄糖、纤维二糖、果糖、鼠李糖、七叶苷和水杨苷的发酵。EⅡC基因缺失后,LM928对HCMEC/D3的侵袭率极显著下降(P<0.01),黏附能力无显著变化(P>0.05)。LM928ΔEⅡC胞内增殖菌量在2~4 h时显著低于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05),但在8~12 h时均显著高于LM928和CLM928ΔEⅡC(P<0.05)。在BHI培养条件下,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、actA、plcB、inlA、inlB、inlC和mpl转录水平极显著下调(P<0.01),毒力基因plcA转录水平极显著上调(P<0.01);在侵染HCMEC/D3后,LM928ΔEⅡC毒力基因hly、prfA、inlB、inlC和mpl转录水平相对于LM928和CLM928ΔEⅡC显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因plcA和inlA相比于CLM928ΔEⅡC极显著下调(P<0.01),毒力基因actA和plcB转录水平无显著差异(P>0.05)。【结论】LIPI-4中EⅡC不参与LM928的生长及其对部分糖的发酵,能调控LM中重要的侵袭相关基因和毒力相关基因。本试验结果为进一步探究EⅡC在LM和LIPI-4中的作用奠定基础。

沙门菌毒力基因研究进展

沙门菌具有染色体和质粒毒力基因。毒力岛是存在于细菌染色体上编码毒力相关基因的特定区域,SPI含有许多与毒力有关的基因,其中,SPI1含有与细菌侵袭力有关的毒力基因,含有这些基因编码型分泌系统的成分;SPI2编码细菌含有在吞噬细胞和上皮细胞内复制的相关基因。除染色体上的毒力岛编码的毒力基因外,还有小部分毒力基因位于毒力质粒上。论文就沙门菌毒力岛、毒力质粒上毒力基因的研究进展进行综述。

携带HPI毒力岛的大肠杆菌的毒力基因分析

目的检测分离自腹泻病人、家禽粪便和食品标本的携带HPI毒力岛的大肠杆菌携带其他致病性相关基因组岛的情况。方法运用PCR和DNA打点杂交方法。结果在被检测的82株大肠杆菌中,志贺氏菌属的Shi-2岛检出率为62.2%(51/82);大肠杆菌O157:H7的8个O岛中,OI55和OI140的检出率为57.3%(47/82),且二者协同存在;OI28的检出率为35.4%(29/82),OI115的检出率为68.3%(56/82),OI144的检出率为9.8%(8/82),OI43和OI122则均未检出。该82株大肠杆菌中78株携带至少2个毒力岛,如编码RTX的OI28岛、编码III型分泌系统的OI115岛以及编码粘附素的OI144岛,另外还有4株菌携带7个基因岛,20株菌携带6个基因岛。结论一些和细菌致病性有关的基因组岛在肠道大肠杆菌中广泛存在,其中一部分有可能是致病性的,提示基因横向转移在致病性大肠杆菌进化过程中具有重要意义。

腹泻仔貉检出携带耶尔森菌HPI毒力岛的大肠杆菌

目的为了解大肠杆菌引起仔貉腹泻的机理,进行了小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因的检测,并对其菌株作毒力试验。方法用PCR扩增法检测毒力岛基因irp2和fyua,小鼠腹腔注射检测菌株毒力。结果从3个貉场腹泻病死貉脏器以及粪便中分离出血清型分别为O23和O20的大肠杆菌,对两血清型大肠杆菌进行毒力岛检测,均检出携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyuA。2个血清型O23、O20大肠杆菌均分别使小鼠发病死亡。结论仔貉腹泻是由携带小肠结肠炎耶尔森菌HPI毒力岛基因irp2和fyua的大肠杆菌引起,该菌对仔貉的健康具有潜在的威胁。

粤北地区仔猪腹泻源大肠杆菌毒力基因检测及致病性初步研究

采用PCR方法对56株仔猪黄白痢源大肠杆菌肠毒素和耶尔森菌强毒力岛(HPI)相关毒力因子STa、STb、LT和irp2进行检测,进而根据毒力因子基因型对部分菌株进行致病性试验。结果显示,38株受试菌检测到毒力因子,其中STa基因阳性率为3.57%,STb基因阳性率为53.57%,LT基因阳性率为7.14%,irp2基因阳性率为21.43%,检测的毒力因子表现为5种基因型,主要的毒力因子基因型是STb和STb+irp2。致病性试验显示毒力基因阳性菌株均对小白鼠具有致病性。结果表明,粤北地区致仔猪黄白痢大肠杆菌流行的主要毒力因子为STb,其次为irp2、少数菌株携带STa和LT毒力因子,相关毒力基因检测可以作为快速确定大肠杆菌致病性的重要依据。

幽门螺杆菌致病相关基因集群多态性的研究

目的基因多态性已逐渐成为幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)新的研究热点。文中旨在研究临床Hp菌株中cagA、cagM、cagZ、cagⅠ-Ⅱ接点、IS605等cag致病岛(cag pathogenicity island,cagPAI)相关的遗传学位点的多样性分布及其与胃十二指肠疾病的关系。方法参照标准菌株NCTC11638序列设计引物,特异性PCR方法检测253株Hp菌株中,cagA、cagM、cagZ基因、cagⅠ-Ⅱ接点以及IS605等不同遗传学位点的分布情况。结果 253株临床分离的Hp菌株中,cagA基因的检出率为92.5%(234/253);cagM的检出率为86.2%(218/253);cagZ的检出率为66%(167/253);在慢性非萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌中的检出率差异均无统计学意义(P>0.05)。仅5.1%(13/253)的Hp菌株中可检测到具有西方菌株特征的cagⅠ-Ⅱ接点的存在,提示中国大部分菌株中的cagⅠ-Ⅱ接点存在明显不同于西方菌株的结构形式;含西方菌株连续状态特征的cagPAI在消化性溃疡中13.3%(10/75)的检出率明显高于慢性非萎缩性胃炎中1.4%(2/146)的检出率(P<0.01)。IS605在慢性非萎缩性胃炎中51.4%(75/146)的检出率明显高于消化性溃疡中28%(21/75)的检出率(P<0.01)。结论cagPAI集群的序列结构具有丰富的基因多样性;cagA、cagM、cagZ等遗传学位点单独无一可作为临床Hp菌株的毒力标志;IS605的存在可能影响菌株的毒力发挥;cagⅠ-Ⅱ接点区域可能存在中国或东亚菌株的特征性结构。

中国人感染幽门螺杆菌中检出cagⅠ的结构差异

目的探讨cag致病岛基因群的右半部分cagI中cagA与cagM在中国人群感染幽门螺杆菌(H.pylori)中存在的差异及意义。方法采用PCR方法检测了107例临床分离培养的H.pylori菌株,选择cagI中的cagA和cagM为观测对象,分别扩增cagA中的298bp片段及cagM中的170bp片段。结果 cagA阳性的检出率为92.5％,cagM阳性的检出率为86.9％、cagA,cagM在慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等不同疾病组间的检出率无显著差异(P>0.05),其中cagA与cagM均阳性的检出率为85％(91/107)、cagA阳性、cagM阴性的检出率为7.5％(8/107)、cagA阴性、cagM阳性的检出率为1.9％(2/107),cagA与cagM均阴性的检出率为5.6％(6/107),即在9.4％的H.pylori中,cagA与cagM的检出存在不一致性。结论 cagA与cagM检出的不一致性表明,中国人群感染的H.pylori中,cag致病岛不仅存在cagⅠ与cagⅡ之间分割、重排和缺失,还发现在cagⅠ基因群内部,即在cagA和cagM之间出现新的分割、重排和缺失位点,以及存在新的cag致病岛结构形式。

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10^(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。

肠球菌毒力岛基因的检测

目的探索肠球菌中毒力岛基因的存在情况。方法使用PCR和杂交方法对155株肠球菌进行毒力岛相关基因检测。结果155株肠球菌中,88.39%携带至少一个毒力岛基因,各基因阳性率由高至低依次为hyd(81.94%),psaA(78.06%)、nuc(57.42%)、esp(53.55%)、cylB(52.90%)和gls24-like(38.06%);除esp基因,其他5个基因的阳性率均是粪肠球菌高于屎肠球菌,其中nuc、cylB、gls24-like三个基因的阳性率有统计学差异。粪肠球菌中临床分离株各基因的阳性率和所携带的基因数均高于健康人分离株。结论肠球菌普遍携带毒力岛相关基因,粪肠球菌各基因阳性率高于屎肠球菌,粪肠球菌中临床分离株所携带的毒力基因、毒力岛基因数目均明显高于健康人分离株。

致病菌基因组岛的研究进展

细菌基因组岛是细菌基因组上的特定区域,和水平基因转移相关,具有一定的结构特点,常携带致病、耐药及与适应性等功能相关的基因。通过基因组岛在细菌间的移动,可以造成相关基因在细菌间的传播,在细菌生存和致病等过程中具有重要作用。目前已经可通过生物信息和分子生物学实验等方法对基因组岛进行预测和验证。通过对致病菌基因组岛的研究,可以阐释细菌致病性和耐药等重要功能的获得,对疾病进行溯源,在传染病预防控制中具有重要意义。

正畸牙龈炎患者中牙龈卟啉单胞菌致病岛Rag基因的检测及其致病性分析

目的:分析不同rag基因型牙龈卟啉单胞菌(Pg)在正畸牙龈炎患者中的分布状况。方法:41例患者为戴用矫治器后发生牙龈炎者(正畸治疗组),36例为未戴矫治器牙周健康者(对照组),25例为中、重度牙周炎患者(牙周炎组)。利用多重PCR技术检测受试者龈沟液标本中牙龈卟啉单胞菌及致病岛rag基因,分析其与临床指标之间的相互关系。结果:牙龈卟啉单胞菌阳性率(%)在正畸治疗组、对照组和牙周炎组分别为70.7、36.1和92.0(P<0.01)。在Pg阳性患者(正畸治疗组和牙周炎组)rag基因型检出率依次为rag-3、rag-4、rag-1和rag-2。结论:不同rag基因型P.gingivalis在不同病变组织中的分布不同;rag-3型和rag-4型Pg与牙龈炎的发生发展有密切关系。

环丙沙星对沙门菌毒力岛基因invA影响的分析

目的:分析沙门菌毒力岛基因invA在不同血清型的基因变异和耐环丙沙星菌株中基因突变情况,及环丙沙星对沙门菌生长能力的影响。方法:用微量肉汤稀释法测定6个血清型的40株沙门菌的环丙沙星MIC;采用多阶段筛选法对敏感菌株诱导环丙沙星耐药株;对invA基因进行测序比对,分析其基因变异和突变情况;测定诱导前后沙门菌的生长曲线。结果:不同血清型的沙门菌其invA基因序列存在不同程度的变异,但均属于沉默突变;环丙沙星耐药株未发现invA基因突变或缺失;环丙沙星诱导后沙门菌的生长能力明显减弱(P<0.001)。结论:invA基因在不同血清型的变异,说明沙门菌的毒力仍在进化中;环丙沙星未引起invA基因的突变或缺失,但可使沙门菌的生长能力下降。

幽门螺杆菌细胞毒导致胃癌发生的作用机制

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染导致胃癌的重要原因之一是它的细胞毒作用。细胞毒素相关基因致病岛(cytotoxin-associated gene pathogenicity island,cagPAI)和空泡毒素A(vacuolatingcytotoxin A,vacA)是Hp最典型的细胞毒代表。cagPAI可诱发促炎因子的释放及增强促上皮细胞增殖信号的兴奋程度;vacA则导致上皮空泡化和病原体黏附。明确cagPAI和vacA在胃癌发生发展过程中的作用,将有利于全面理解Hp感染对机体造成的危害以及根治Hp感染的重要意义。

一起伦敦沙门氏菌食物中毒分离株的病原特征分析

目的分析2020年广州市一起伦敦沙门氏菌食物中毒分离株的病原特征。方法对分离纯化的10株沙门氏菌进行血清型鉴定,耐药检测,毒力岛(Salmonella pathogenicity island, SPI)基因片段SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5的PCR检测及脉冲场凝胶电泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分析。结果 10株沙门氏菌血清型鉴定抗原式均为O10:l、v:1、6,即伦敦沙门氏菌,药敏实验显示10株沙门氏菌对氨苄西林(ampicillin,AMP)、萘啶酸(nalidixicacid,NAL)、头孢唑林(cefazolin,CFZ)、复方磺胺(compound sulfamethoxazole tablets,SXT)、氨苄西林/舒巴坦(ampicillin/sulbactam,AMS)100%耐药,对头孢噻肟(cefotaxime, CTX)、头孢西丁(cefoxitin, CFX)、头孢他啶(ceftazidime, CAZ)、亚胺培南(imipenem, IPM)、庆大霉素(gentamicin,GEN)、四环素(tetracycline,TET)、氯霉素(chloramphenicol,CHL)、环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)100%敏感。毒力岛基因SPI-1~SPI-5全部为阳性。脉冲场凝胶电泳法(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)聚类分析显示,5株病患株、3株食品株、2株环境株为高度同源株。结论引起此次食物中毒事件的病原菌是伦敦沙门氏菌,应进一步加强餐饮环节的卫生监测和控制。

肠聚集性大肠杆菌ybtE基因缺失突变株的构建

目的构建肠聚集性大肠杆菌ybtE缺失突变株,为下一步ybtE基因功能的研究奠定基础。方法应用PCR扩增肠聚集性大肠杆菌的ybtE基因,将其克隆至pUC18载体,酶切缺失988bp ybtE片段,并插入998bp的卡那霉素抗性基因,利用定向克隆技术将突变的ybtE片段克隆至自杀质粒pKTN701,形成重组自杀质粒。将携带重组自杀质粒的SM10λpir与EAEC17-2进行接合转移,利用同源重组,根据卡那霉素抗性筛选并鉴定接合子。结果经PCR、酶切和探针杂交鉴定,得到2株肠聚集性大肠杆菌ybtE缺失突变株。结论成功构建肠聚集性大肠杆菌ybtE基因缺失突变株。

应用LAMP技术鉴定含89K毒力岛2型猪链球菌菌株

目的应用LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)技术鉴别含89K毒力岛2型猪链球菌(Streptococ-cus suisserotype2,S.suis2)菌株。方法根据S.suis2中国分离株(05ZYH33)89K毒力岛中基因序列设计4条引物(2条内引物、2条外引物);应用LAMP,对21株S.suis2、18株其它链球菌、9株葡萄球菌、5株其它菌株及49份未知样本进行检测,并对LAMP的最低检测限进行测试,结果通过肉眼目测或电泳检测,并将结果与PCR/定量PCR结果比较。结果该方法仅对含89K毒力岛的中国S.suis2特有株检测为阳性,而其它菌株经LAMP检测均为阴性,试验表明本方法特异性好,其最低检测限为24CFU/反应,无需特殊设备,结果通过肉眼即可判断,从菌株核酸的提取至检测完成仅需2h左右。应用本方法对49份不同来源样本进行实际考核,其中32份不明发热病人呼吸道咽拭子应急样本及15份正常猪扁桃体咽拭子样本经检测89K毒力岛基因均为阴性,2份疑似SS2病人血液应急样本中一份检测到该毒力岛基因,该结果与普通PCR/定量PCR检测结果一致。结论成功建立了检测S.suis289K毒力岛的LAMP方法 ,该方法特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,操作简单方便,极适合在我国广大基层实验室(包括基层医院/动物检疫等部门)开展应用。

霍乱弧菌O139和ElTor菌株毒力岛区域分子特征比较

目的:比较O139霍乱弧菌(VCO139)菌株MO45基因组与O1群ElTor霍乱弧菌(EVC)菌株N16961基因组中毒力岛(VPI)区域分子特征。方法:制备霍乱弧菌VPI上游VC0815基因探针。从VCO139菌株MO45基因组文库中筛选一个既含有VC0815基因又含有tcpA基因的克隆,命名为pCOSVC081545,绘制pCOSVC081545VPI上游片段的限制性酶切图谱,并与N16961同段序列的限制性酶切图谱进行比较。结果与结论:pCOSVC081545和N16961中VPI上游约1500bp片段的限制性酶切图谱基本相同,支持O139霍乱弧菌是EVC O抗原突变而来的观点。

病原菌毒力岛研究进展

毒力岛作为基因组岛的一种亚类,是细菌染色体上具有特定结构和功能特征的可移动基因大片段,经基因水平转移(转导、接合或转化)获得,可使细菌基因组进化在短期内发生"量的飞跃",直接或间接增强细菌的生态适应性,与病原菌的致病性密切相关。毒力岛存在于多种动植物病原细菌中,对于细菌的毒力变异、遗传进化甚至新病原亚种形成有重要意义。简要综述了病原菌毒力岛的研究进展,介绍了毒力岛的结构、功能特征及其在病原菌进化中作用。

牙龈卟啉单胞菌致病岛研究进展

牙龈卟啉单胞菌是重要的牙周可疑致病菌,在牙周炎的发生和发展过程中发挥着重要的作用。致病岛是病原微生物通过基因水平转移获得的外源性DNA片段,与细菌的致病性密切相关。下文就牙龈卟啉单胞菌致病岛的研究现状作一综述。