HPLC法测定药用辅料L(+)-酒石酸中的D(-)-酒石酸含量

目的:建立HPLC法测定药用辅料L(+)-酒石酸中D(-)-酒石酸的含量。方法:采用手性柱CHIRALPAK IC(250mm×4.6mm,5μm);以乙醇-正己烷-三氟乙酸(200∶800∶1)为流动相进行等度洗脱;流速0.5mL·min^(-1);检测波长210nm,柱温25℃。结果:D(-)-酒石酸在4.1094~20.5474μg·mL^(-1)范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9998),L(+)-酒石酸在4.1302~20.6514μg·mL^(-1)范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.9997);D(-)-酒石酸的加样回收率(n=9)范围为99.6%~100.4%;定量限浓度为4.1094μg·mL^(-1)。结论:本方法准确可靠,重复性好,灵敏度高,为该药用辅料的产品质量控制提供依据。

产顺式环氧琥珀酸水解酶的博德特氏菌BK-52的筛选、鉴定及其产酶条件优化

【目的】产顺式环氧琥珀酸水解酶(CESH)新型菌株的筛选、鉴定及其产酶条件优化。【方法】通过电镜、Biolog GN、(G+C)含量和16S rDNA序列研究,对筛选菌株进行分类鉴定。通过红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱、质谱以及旋光度实验,鉴定纯化产物的结构并优化CESH产酶条件。【结果】本文筛选出一株产CESH的新型菌株,该菌株可将顺式琥珀酸盐转化为D(-)-酒石酸,属于博德特氏菌属,并将其命名为博德特氏菌BK-52。最佳发酵条件为:最佳温度30°C,最佳pH7.0,最佳发酵时间36h,最佳碳源蔗糖,最佳无机氮源硫酸铵,最佳酶诱导剂顺式环氧琥珀酸二钠。在此最佳条件下,CESH酶活最高达764U/g生物量。【结论】本文筛选的新菌株博德特氏菌BK-52为D(-)-酒石酸的生产提供了一种新的方法。

D(-)-二吡啶甲基酒石酸酰胺在不对称氧化合成埃索美拉唑中的应用

D(-)-酒石酸二乙酯(1)分别与2-氨甲基吡啶和4-氨甲基吡啶反应,合成了D(-)-二吡啶甲基酒石酸酰胺2和3.分别以1～3为手性配体与钛酸异丙酯配合,催化过氧化氢异丙苯(CHP)不对称氧化埃索美拉唑前体(Eso-I)合成埃索美拉唑.结果表明,由配体2或3构成的催化体系在埃索美拉唑合成上显示出较高的催化活性和对映选择性.例如,当以2为配体,甲苯为溶剂,在优化的条件下进行反应时,Eso-I的转化率达84.7%,埃索美拉唑的选择性达91.8%,对映体过量值达89.0%.

定向进化和半理性设计改造顺式环氧琥珀酸水解酶

【背景】D(-)-酒石酸是非天然有机酸,在保健品、食品和肿瘤药物合成等行业具有重大应用潜力,目前主要通过生物转化法生产,即顺式环氧琥珀酸水解酶[cis-epoxysuccinic acid hydrolase,CESH(D)]水解顺式环氧琥珀酸(cis-epoxysuccinic acid,ESH)生成D(-)-酒石酸。该法简单温和,但存在CESH(D)酶活转化效率低下的瓶颈问题。【目的】通过基因工程改造,提高CESH(D)的酶活力、温度和pH稳定性。【方法】利用定向进化和半理性设计体外改造CESH(D),高通量筛选出正向突变体;然后对其进行酶学性质研究,包括比酶活、温度和pH对酶催化效率的影响、酶的温度稳定性、pH稳定性及酶促动力学分析;最后通过分子对接等手段分析突变位点影响催化活性的初步机制。【结果】筛选获得4个正向突变体L231P/N226S、V77I、D183E和T223S。与野生型相比,4个突变体的比酶活分别提高2.2、1.6、1.5和1.4倍。其中,L231P/N226S的温度稳定性和pH稳定性较野生型均有显著提高,55℃时催化活性为野生型的1.6倍,pH 6.0时催化活性为野生型的1.2倍。动力学分析发现,突变体L231P/N226S和T223S对底物ESH的亲和力有明显提升,Km值分别为20 mmol/L和21 mmol/L,较野生型分别降低18%和16%。分子对接研究表明,突变位点主要通过改变底物结合口袋促进酶与底物的相互作用,从而影响酶活。【结论】获得了温度和pH稳定性好、催化活性明显提高的CESH(D)突变体,初步分析突变位点影响酶活的机制,为进一步研究CESH(D)的结构-功能关系及深入改造提供指导。