FTO、GSDMD在胃癌组织中的表达及其作用机制研究

目的探讨肥胖相关蛋白(FTO)与消皮素D(GSDMD)在胃癌(GC)组织中的表达及其作用机制。方法通过TIMER 2.0数据库分析FTO及GSDMD在GC组织中的差异表达。收集2022年1月至2023年3月广西医科大学第二附属医院手术切取的GC组织及其对应癌旁组织(距离肿瘤边缘3~5 cm)各45例,并收集患者的临床病理资料。采用免疫组织化学染色法检测组织中FTO、GSDMD的表达情况,分析其与患者临床病理特征的关联性。通过转染低表达FTO慢病毒构建低表达FTO的AGS细胞(FTO低表达组),并以转染空载体慢病毒的细胞作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测两组细胞FTO mRNA、GSDMD mRNA的表达水平;采用细胞划痕实验及细胞迁移实验分析两组细胞迁移能力。结果基于TIMER 2.0数据库的分析结果及免疫组织化学染色结果显示,FTO、GSDMD在GC组织中呈高表达(P<0.05)。FTO和GSDMD高表达均与肿瘤侵犯深度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。细胞实验结果显示,FTO低表达组的GSDMD mRNA表达水平显著低于对照组(P<0.05),划痕愈合率更低,细胞迁移数更少,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论FTO可能通过调控GSDMD表达促进GC细胞转移。

艾司洛尔通过阻断NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路抑制早期脓毒症大鼠心脏炎症反应及焦亡

目的研究艾司洛尔(Esmolol,ES)是否可通过抑制焦亡的经典通路进而发挥心脏保护作用。方法 72只大鼠随机分为假手术(sham operation,Sham)组、盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)组和ES组,每组24只。每组随机抽取8只大鼠观察生存情况,剩余16只大鼠根据处理时间分为6 h和24 h两个亚组,每组8只。Sham组仅给予开腹,翻动盲肠处理;CLP组和ES组采用CLP法建立脓毒症大鼠模型。Sham组、CLP组持续经大鼠左颈内静脉泵入生理盐水6 h;ES组持续泵入艾司洛尔稀释液6 h。分别于相应时间点处死大鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-1β、IL-18水平,采用免疫印迹法(Western blot)检测心肌组织NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表达水平;光学显微镜下观察心肌病理改变;荧光显微镜下观察心肌细胞焦亡情况。结果 (1)ELISA结果显示,与各时间点的Sham组比较,ES组大鼠血清IL-1β及IL-18水平均明显升高,24 h组最高;而与CLP组比较,上述因子水平在6 h与24 h均明显下降(P <0.05)。(2)Western blot结果显示,术后各时间点,大鼠心肌组织中焦亡经典通路相关蛋白[NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding domain(NOD)-like receptor protein 3,NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1 (cysteinyl aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)、消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)]在CLP组均显示出高表达状态,较Sham组明显升高(P <0.05),24 h组表达量最高,而ES组各时间点上述蛋白表达水平均较CLP组有所减少,且差异统计学意义(P <0.05)。(3)病理结果显示,Sham组大鼠心肌组织可见轻微的病理损伤,CLP组心肌细胞损伤最重,ES组大鼠的心肌细胞破坏较CLP组减轻程度多,各组24 h损伤程度均较6 h重。(4)24 h Tunel与DAPI染色显示,与Sham组可见的少量阳性细胞比较,CLP组可见大量被染色的阳性细胞,且差异有统计学意义(P <0.05);而与CLP组比较,ES组心肌细胞阳性染色数量明显减少(P <0.05)。(5) 7 d生存分析显示,CLP组大鼠死亡率最高,ES组大鼠生存天数较CLP组明显延长,差异有统计学意义(P <0.01)。结论 ES能减轻心肌损伤,提高脓毒症大鼠生存率,其机制可能与抑制焦亡经典通路中NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达及减少炎症因子释放有关。

高氧暴露BPD小鼠模型中巨噬细胞焦亡的检测及意义

目的 探讨巨噬细胞焦亡是否参与支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)的肺病理损伤。方法 40只足月新生小鼠随机分为空气(room air,RA)组和高氧(hyperoxia,HO)组,每组20只。建立慢性高氧诱导的BPD小鼠模型。HE染色评估小鼠的肺泡化情况;CD31免疫组化检测肺血管发育状况;Masson染色分析肺组织的纤维化程度;qRT-PCR检测肺组织中的炎症因子和趋化因子(Il6、Il1b、Mmp12、Ccl2、Ccl5、Il8)基因表达水平;ELISA检测血清和肺组织匀浆中的IL-1β水平;Western blot检测细胞焦亡通路的关键蛋白NLRP3、Caspase-1 p20、N-消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、IL-1β表达;流式分析支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例;免疫荧光检测F4/80与NLRP3/Caspase-1/IL-1β的共定位;免疫组化分析AQP5的表达水平。结果 与RA组相比,HO组小鼠的肺泡化阻滞和肺血管生成障碍,肺纤维化显著增加;肺组织中促炎细胞因子的表达显著上调,细胞焦亡相关蛋白表达水平显著增加,血清和肺组织匀浆中IL-1β水平显著升高;支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞比例显著升高,肺组织中F4/80与NLRP3、Caspase-1、IL-1β均存在显著的免疫荧光共定位现象,AQP5阳性的肺泡Ⅰ型上皮细胞严重受损。结论 高氧诱导的BPD小鼠模型中,NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路过度活化,可能导致BPD的肺部病理损伤。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H-2^(h4)小鼠AIT细胞焦亡的机制

目的:基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠细胞焦亡的作用机制。方法:60只NOD.H-2h4小鼠分为正常组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量(4.10、8.19、16.38 g·kg^(-1))组和硒酵母片(0.26 mg·kg^(-1))组,每组10只。除正常组外,其余各组均给予0.05%碘化钠(NaI)灌胃8周造模,继续给药干预8周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理学改变;免疫组化法检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织中细胞焦亡相关蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TPO-Ab、Tg Ab水平显著升高(P<0.01),甲状腺滤泡或增大呈立方状,或破坏萎缩,滤泡周围可见大量淋巴细胞浸润;与模型组比较,给药组TPO-Ab、Tg Ab水平显著降低(P<0.01),滤泡形态结构有所改善,淋巴细胞浸润程度有所减轻,其中补中益气汤中剂量组降低和改善效果最为明显。与正常组比较,模型组小鼠甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达显著增加(P<0.01),NLRP3、剪切的(cleaved) Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),其中补中益气汤中剂量组降低效果最为明显,给药组NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT,其机制可能是通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡实现的。

血清半胱氨酸蛋白酶-1、Gasdermin家族蛋白D、Gasdermin家族蛋白D-N端在银屑病患者血清及皮损中的表达和意义

目的检测寻常型银屑病患者血清半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)及皮损Caspase-1、Gasdermin家族蛋白D(GSDMD)、Gasdermin家族蛋白D-N端(GSDMD-N)的表达水平,进一步探索细胞焦亡在银屑病中的作用。方法将进行期寻常型银屑病的30例患者纳入银屑病组(PSO组),收集30例患者的血清样本和其中20例患者的皮损样本,并收集同时期在苏北人民医院体检中心体检的30例健康者的血清和整形外科20例健康求美者的皮肤组织(皮损)纳入健康对照组(CON组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法(qRT-PCR)检测2组血清Caspase-1 mRNA的表达水平;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测2组血清Caspase-1的含量;采用蛋白免疫印迹法检测2组皮肤组织中Caspase-1蛋白的表达水平;采用免疫组织化学(IHC)法检测2组皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N的表达及分布情况。结果PSO组患者血清中Caspase-1 mRNA表达水平高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组血清中Caspase-1蛋白表达水平为(1047.74±276.20)pg/mL,高于CON组的(371.20±160.84)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组与CON组的Caspase-1总体蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);PSO组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白表达水平低于CON组,Cleaved Caspase-1蛋白表达水平和GSDMD蛋白表达阳性率高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组皮损中GSDMD-N蛋白表达阳性率高于CON组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论进行期寻常型银屑病患者血清及皮损中Caspase-1和皮损中GSDMD、GSDMD-N表达增加,提示细胞焦亡通路可能参与寻常型银屑病的发生和发展。

益气养阴活血方对糖尿病肾病大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路的影响

目的:基于NOD样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶^(-1)(Caspase^(-1))/消皮素D(GSDMD)细胞焦亡通路,探讨益气养阴活血方防治糖尿病肾病(DKD)肾脏损伤的可能作用机制。方法:随机将50只雄性SD大鼠分为正常组8只、造模组42只。造模组高糖高脂饮食6周后予一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立DKD大鼠模型。造模成功后随机分为模型组、缬沙坦组(8.33 mg·kg^(-1))、益气养阴活血方低、高剂量组(11、22 g·kg^(-1))。连续灌胃6周后检测各组大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)及24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理形态学变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清白细胞介素^(-1)β(IL-1β)、白细胞介素^(-1)8(IL^(-1)8)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG、CHO、TG、BUN、SCr、24 h-UTP及血清IL-1β、IL^(-1)8水平均显著升高(P<0.01),肾组织病变程度严重,且肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,各药物组FBG、CHO、TG、BUN、SCr、24 h-UTP及血清IL-1β、IL^(-1)8水平均明显下降(P<0.05,P<0.01),肾组织病变程度得到改善,且肾组织NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD蛋白及其mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),以益气养阴活血方高剂量组效果最佳。结论:益气养阴活血方可通过调控NLRP3/Caspase^(-1)/GSDMD通路抑制细胞焦亡,缓解DKD大鼠炎症反应,减轻肾脏病理损伤。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的作用机制

目的:探讨参芪抑瘤方干预细胞焦亡在抗肿瘤效应中的作用机制。方法:随机抽取10只BALB/c小鼠(雄性)作为正常组,余40只建立肝癌小鼠异位移植瘤模型,建模5 d后随机分为模型组、顺铂组[2.5×10^(-3)g·kg^(-1)·(3 d)^(-1)]、参芪抑瘤方组(27 g·kg^(-1)·d^(-1))、联合组(参芪抑瘤方+顺铂)。正常组与模型组以等量生理盐水灌胃,连续干预10 d,观察各组小鼠一般情况,干预结束后,称量小鼠瘤体质量,计算抑瘤率,采用苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理变化;检测小鼠肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测小鼠肿瘤组织细胞DNA损伤情况;免疫组化(IHC)、免疫荧光(IF)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测瘤组织中NOD样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测瘤组织中白细胞介素(IL)-1β和IL-18的含量。结果:与正常组比较,模型组小鼠精神状态差,倦卧懒动,毛色暗淡;肝功能检测血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠精神状态明显好转,且各给药组均可不同程度抑制瘤体生长,肿瘤质量均下降,其中联合组抑瘤率最强(P<0.01);HE染色示,模型组小鼠肿瘤组织病理形态学病变显著,各给药组均有一定程度改善,以参芪抑瘤方组及联合组细胞核,溶解破裂更为明显;肝功能检测中,参芪抑瘤方组及联合组小鼠血清ALT、AST水平均下降显著(P<0.01);各给药组炎症因子IL-1β和IL-18均下降(P<0.05,P<0.01);TUNEL染色示各给药组干预后TUNEL染色阳性降低(P<0.05,P<0.01),以顺铂组和参芪抑瘤方组降低显著(P<0.01);Western blot、免疫组化、免疫荧光在肿瘤组织中检测发现,各给药组NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表达水平均下降(P<0.05,P<0.01)。与顺铂组比较,参芪抑瘤方组和联合组小鼠精神状态佳,瘤体形态规则,联合组小鼠肿瘤质量下降(P<0.05);参芪抑瘤方组ALT和AST水平下降(P<0.05);参芪抑瘤方组和联合组IL-1β和IL-18均下降(P<0.05,P<0.01),以联合组最为明显(P<0.01);免疫组化结果显示,联合组小鼠肿瘤组织中GSDMD蛋白表达显著降低(P<0.01);免疫荧光检测发现参芪抑瘤方组NLRP3在肿瘤组织中表达显著降低(P<0.01);Western blot结果显示参芪抑瘤方组及联合组NLRP3蛋白表达水平下降显著(P<0.01),联合组Caspase-1蛋白表达水平下降显著(P<0.01);GSDMD蛋白表达下降不明显,差异无统计学意义。结论:参芪抑瘤方联合顺铂具有明显抑瘤作用,其抗肿瘤作用可能是通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD炎性焦亡途径抑制细胞焦亡,缓解肝癌小鼠的炎症反应,达到抗肿瘤的作用。

抑制肺泡上皮细胞焦亡对支气管肺发育不良新生大鼠肺泡化阻滞的改善作用

目的·研究gasderminD(GSDMD)抑制剂necrosulfonamide(NSA)通过抑制肺上皮细胞焦亡对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的新生大鼠支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)肺泡化阻滞的影响。方法·将孕SD大鼠随机分为对照组、BPD组、BPD+NSA组和NSA组,羊膜腔注射LPS建立新生鼠BPD模型。取各组出生后第1、3、7日新生鼠肺组织,通过苏木精-伊红(H-E)染色观察肺泡化情况;利用免疫荧光法检测各组新生鼠肺部GSDMD-N端蛋白表达情况;荧光定量PCR法检测新生鼠肺组织中炎症因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)mRNA水平。体外培养小鼠肺泡上皮细胞系MLE-12,给予LPS以及腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)刺激和NSA干预,CCK-8法检测MLE-12细胞活力,Hoechst 33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法检测细胞焦亡水平,免疫荧光法检测MLE-12细胞表面活性剂蛋白C(surfactant protein C,SFTPC)和GSDMD-N端蛋白的表达情况。结果·体内实验结果显示:羊膜腔内注射LPS可导致肺发育受阻,模拟BPD的病理改变;羊膜腔内注射LPS建立的BPD模型中肺泡上皮细胞GSDMD-N端表达升高;NSA干预明显改善了BPD新生鼠的肺发育阻滞并抑制了IL-1β的mRNA表达(均P<0.05)。体外实验结果显示:LPS/ATP刺激下肺泡上皮细胞MLE-12活力下降,发生焦亡;NSA干预提高了肺泡上皮细胞活力并且抑制了焦亡(均P<0.05);NSA上调了LPS/ATP刺激下肺泡上皮细胞SFTPC的表达,抑制了LPS/ATP刺激下肺泡上皮细胞GSDMD-N端表达的上调(均P<0.05)。结论·抑制肺泡上皮细胞焦亡可改善LPS诱导的BPD新生鼠肺组织病理学改变。

丹蒌片对痰瘀互结型缺血性脑卒中后大鼠NLRP3/GSDMD细胞焦亡通路的影响

目的:探究丹蒌片对痰瘀互结型缺血性脑卒中后大鼠的保护作用。方法:48只大鼠随机分为假手术组,模型组,丹蒌片低、高剂量组(0.45、0.9 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组12只。建立痰瘀互结型大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,造模后灌胃给药,术后24 h和72 h对MCAO模型大鼠进行神经功能缺损评分;7 d后取材。以TTC染色测定大鼠脑梗死体积;免疫组织化学检测大鼠脑组织中Gasdermin D(GSDMD)和NLRP3蛋白的表达水平;Western blot和实时荧光定量PCR分别检测大鼠脑组织中GSDMD、Caspase-1、IL-1β、NLRP3mRNA和蛋白表达水平。结果:与模型组比较,丹蒌片高剂量组大鼠神经功能缺损评分显著降低(P<0.05),脑梗死百分比显著减小(P<0.05)。与模型组比较,丹蒌片低、高剂量组NLRP3、GSDMD蛋白表达显著减少(P<0.05)。与模型组比较,丹蒌片低剂量组GSDMD、Caspase-1、IL-1β、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),丹蒌片高剂量组GSDMD、Caspase-1、NLRP3 mRNA和蛋白表达水平显著降低,IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:丹蒌片可改善痰瘀互结型缺血性脑卒中后大鼠相关症状,降低细胞焦亡相关的蛋白表达。

寿胎丸通过调控Caspase-1/GSDMD通路发挥干预复发性流产的作用

目的基于蜕膜组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)/消皮素D(gasdermin D,GSDMD)通路,探讨寿胎丸对复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion,RSA)小鼠的安胎机制。方法采用CBA/J×BALB/c小鼠复制正常妊娠模型,作为空白组;CBA/J×DBA/2小鼠复制RSA模型,随机分为模型组,寿胎丸低、中、高剂量组。实验小鼠分别给予等体积蒸馏水和不同剂量寿胎丸药液(低剂量:3 g·kg^(-1)·d^(-1);中剂量:6 g·kg^(-1)·d^(-1);高剂量:12 g·kg^(-1)·d^(-1))治疗,连续灌胃14天,计算小鼠流产率;苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠蜕膜组织病理形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血清中Caspase-1、白介素-1β(IL-1β)、白介素-18(IL-18)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠子宫蜕膜组织中Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白和mRNA表达情况。结果与空白组比较,模型组小鼠流产率明显增加,血清中Caspase-1、IL-1β、IL-18含量和子宫蜕膜组织中Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白和mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,寿胎丸中、高剂量均可有效降低小鼠流产率;降低小鼠血清中Caspase-1、IL-1β、IL-18含量以及子宫蜕膜组织中Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白和mRNA表达(P<0.01)。结论寿胎丸可能是通过抑制Caspase-1/GSDMD信号通路介导的子宫蜕膜细胞焦亡而发挥防治流产的作用。

糖尿病小鼠肾组织中细胞焦亡发生的现象研究

目的:观察糖尿病(DM)小鼠肾组织中是否发生细胞焦亡及相关蛋白表达变化。方法:以链脲佐菌素(STZ)复制DM C57BL/6J小鼠模型(DM组),并设立正常对照组(NC组);16周后处死小鼠,测量血清中血糖和血肌酐,采用HE、Masson染色观察两组小鼠肾组织的变化,应用Western blot法及Real Time-PCR检测活性半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、细胞焦亡关键蛋白Gasdermin-D(GSDMD)及其mRNA表达水平。结果:与NC组相比,DM组小鼠血糖及血肌酐升高,HE及Masson染色下见DM组小鼠肾组织中肾小球内基质沉积和胶原纤维增生,部分肾小管上皮细胞可见细胞肿胀、空泡变性、管腔扩张及基底膜增厚;DM组中活性Caspase-1、GSDMD的蛋白及mRNA表达较NC组增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:DM小鼠肾组织中可能发生由Caspase-1激活介导GSDMD触发的细胞焦亡。

非经典细胞焦亡体外模型的构建

旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1-hGSDMD-p30-MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功。结果显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMD-p30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功。非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础。

H2O2诱导人滋养细胞HTR-8/SVneo焦亡模型的建立

目的绒毛外滋养细胞焦亡是否参与子痫前期的发生发展值得探讨。文章旨在构建H 2 O 2诱导滋养细胞焦亡模型,探讨绒毛外滋养细胞焦亡是否参与子痫前期的发生发展,为探究子痫前期发病机制提供新的方向。方法人滋养细胞HTR-8/SVneo培养于1640+10%胎牛血清+1%抗生素中,培养12 h后,给予H 2 O 2(100、150、200、250μmol/L)处理细胞(2、4、6、12 h),对照为1640+10%胎牛血清+1%抗生素正常培养细胞。提取细胞总蛋白,Western blot检测焦亡相关分子蛋白水平的表达;RT-qPCR检测细胞中焦亡相关分子mRNA水平;倒置相差显微镜观察细胞形态学改变。结果当H 2 O 2为150μmol/L,处理人滋养细胞4 h时,焦亡相关分子NLRP3、caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD及IL-1β的蛋白水平明显高于对照,随着作用时间的延长及浓度的增加,蛋白质表达水平被抑制;当H 2 O 2为150μmol/L,作用2 h时,焦亡经典通路中上游“启动”信号关键分子NLRP3及IL-1β的mRNA水平较对照明显升高(P<0.000);4 h时,焦亡经典通路中的关键分子GSDMD的mRNA水平及下游炎症因子IL-18的mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)。通过焦亡相关分子mRNA水平的逆向验证,H 2 O 2诱导滋养细胞焦亡模型最佳条件为150μmol/L和4 h,在该条件下,光镜下可明显看到细胞肿胀、碎裂及质膜气泡形成等细胞焦亡典型改变。结论体外成功建立了氧化应激反应诱导滋养细胞焦亡模型,模拟了氧化应激反应诱导滋养细胞发生焦亡损伤的病生理过程,为后续子痫前期发病机制的研究提供实验基础。

通过GSDMs介导细胞焦亡的天然药物成分在抗肿瘤治疗中的研究进展

近年来发现除凋亡、坏死外的一种非典型新型细胞死亡方式——细胞焦亡,其生物学特征为依赖于胱天蛋白酶(Caspases)家族蛋白切割焦孔素家族(GSDMs)蛋白,使活化的GSDMs蛋白在质膜上作用形成穿孔,导致细胞肿胀裂解,引发炎症及免疫反应。目前,有4种不同的信号途径可诱导细胞焦亡,包括经典和非经典炎性小体通路、凋亡相关Caspases介导的通路和基于颗粒酶的焦亡通路。在这些信号通路中,GSDMs蛋白是最终的细胞焦亡执行者。细胞焦亡与肿瘤细胞死亡及正常组织炎性损伤密切相关,近年的研究发现,适度的细胞焦亡会导致肿瘤细胞死亡,发挥抗肿瘤作用,同时刺激肿瘤免疫微环境;而细胞焦亡不当激活又可促进肿瘤发展。药物抗肿瘤治疗中,如肿瘤免疫治疗、化疗、靶向治疗等手段发挥了较好的抗肿瘤作用,但仍存在耐药、复发、损伤正常组织等不足,而最新的研究表明多种天然药物成分具有通过介导焦亡途径的抗肿瘤作用及辅助抗肿瘤作用,且有多靶点和多通路的特点,这为抗肿瘤治疗的研究提供了新的思路和方法。笔者对细胞焦亡的分子机制、焦亡在肿瘤及肿瘤免疫微环境中的调控作用进行综述,同时重点对调控细胞焦亡的相关天然药物成分在抗肿瘤治疗中的新近研究进行总结,以期为基于细胞焦亡的抗肿瘤治疗与研究提供思路。

电针对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞焦亡非经典途径的调控作用研究

目的:观察电针对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)肝细胞焦亡非经典途径的影响及其作用机制。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为普通饮食组(n=15)和高脂造模组(n=45),高脂造模组以定制高脂饲料喂养8周建立NAFLD模型。从造模成功的大鼠中选取30只随机分为模型组(n=10)、电针组(n=10)和非穴浅刺组(n=10),另从普通饮食组中随机选取10只大鼠作为对照组。电针组大鼠于双侧“丰隆”“肝俞”穴行电针干预,予疏密波,频率4 Hz/20 Hz,电流强度3 mA;非穴浅刺组大鼠于双侧“丰隆”“肝俞”穴旁5 mm处浅刺,电针刺激参数同电针组。两组干预均每日1次,每次20 min,每周5 d,连续干预4周。干预后,采用油红“O”染色法观察各组大鼠肝脏形态;ELISA法检测各组大鼠血清脂多糖(LPS)、白细胞介素(IL)-1β、IL-18以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;Western blot法检测各组大鼠肝脏组织消皮素D(GSDMD)、GSDMD末端氨基结构域(GSDMD-N)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-11、IL-1β、IL-18及TNF-α蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18及TNF-αmRNA表达。结果:模型组大鼠肝细胞胞质中可见大小不等的空泡,脂滴呈片状堆积;与模型组比较,电针组及非穴浅刺组大鼠肝细胞脂滴减少,肝脏脂肪变性程度降低。与对照组比较,模型组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量升高(P<0.01);肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白和mRNA表达升高(P<0.01),GSDMD-N蛋白表达升高(P<0.01)。与模型组比较,电针组及非穴浅刺组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量降低(P<0.01),肝脏组织GSDMD、IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白及mRNA表达降低(P<0.01),肝脏组织GSDMD-N蛋白表达及Caspase-11 mRNA表达降低(P<0.01);电针组大鼠肝脏组织Caspase-11蛋白表达降低(P<0.01)。与非穴浅刺组比较,电针组大鼠血清LPS、IL-1β、IL-18、TNF-α含量降低(P<0.01);肝脏组织GSDMD、Caspase-11、IL-1β、IL-18蛋白和mRNA表达降低(P<0.01),GSDMD-N蛋白及TNF-αmRNA表达降低(P<0.01)。结论:电针干预可抑制NAFLD大鼠肝细胞焦亡,其作用机制可能与降低血清LPS含量,下调细胞焦亡非经典途径相关因子GSDMD、GSDMD-N、Caspase-11、IL-1β、IL-18、TNF-α表达相关。

Gasdermin家族蛋白及其疾病相关性的研究进展

Gasdermin家族蛋白(GSDMs)包括人类的6种蛋白GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSD-MD、GSDME、DFNB59和小鼠的10种蛋白GSDMA1~3、GSDMC1~4、GSDMD、GSDME、DFNB59,可能参与了上皮细胞发育、凋亡、炎症、癌变及免疫相关性疾病等多个生理和病理过程.最新研究发现GSDMD是细胞焦亡中炎性caspase的关键底物,其N端结构域和C端结构域分别具有成孔活性和自抑制作用,从而开辟了GSDMs结构和功能研究的新领域.本文就近年来GSDMs各蛋白结构、功能及其疾病相关性的研究进展作一综述.

电针预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Gasdermin D、半胱氨酸蛋白酶-1及白细胞介素-1β表达的影响

目的:观察电针预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠心肌细胞焦亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)、白细胞介素-1β(IL-1β)的影响,探讨电针预处理减轻MIRI损伤的可能机制。方法:SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、电针组,每组10只。电针组电针大鼠双侧“内关”,每次20 min,每日1次,连续3 d。采用冠状动脉左前降支结扎法复制MIRI大鼠模型。采用超声心动图观察造模4 h后大鼠左心室射血分数(LVEF)以评估心功能;TTC染色法观察大鼠心肌梗死面积;免疫组织化学法观察大鼠心肌组织中GSDMD表达情况;Western blot法检测心肌组织GSDMD、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平。结果:与空白组相比,假手术组心肌组织GSDMD表达升高(P<0.05)。与假手术组相比,模型组大鼠术后4 h时LVEF明显下降(P<0.0001),梗死面积增大(P<0.0001),心肌组织GSDMD表达显著升高(P<0.0001),心肌GSDMD、Caspase-1、IL-1β蛋白表达升高(P<0.001,P<0.0001)。与模型组相比,电针组大鼠术后4 h时LVEF升高(P<0.001),梗死面积缩小(P<0.0001),心肌组织GSDMD表达降低(P<0.001),心肌GSDMD、Caspase-1、IL-1β蛋白表达降低(P<0.01,P<0.001)。结论:电针预处理可能通过下调Caspase-1蛋白的表达,降低心肌细胞焦亡水平,从而改善MIRI损伤。

细胞焦亡在胃癌中的作用及中医药调控研究进展

细胞焦亡是区别于细胞凋亡、坏死、细胞增多症、铁死亡和自噬的一种新型炎性胱天蛋白酶(Caspase)依赖性程序性细胞死亡。细胞焦亡依赖于Caspase蛋白家族的激活,切割关键介质蛋白使细胞膜形成孔隙,诱导促炎细胞因子白细胞介素-1β和白细胞介素-18成熟并释放到细胞外环境中,产生级联炎症反应。胃癌是一种恶性的消化道肿瘤疾病,具有难治愈、预后差、放化疗并发症多等特点。目前胃癌的发病机制尚不明确,越来越多的研究发现,细胞焦亡与胃癌发生发展关系密切,这种新型的死亡方式被广泛关注。细胞焦亡对于胃癌而言是一把双刃剑,一方面可以释放促炎细胞内容物来放大或维持炎症,诱导细胞的“炎-癌”转化;另一方面细胞焦亡可以增强化疗药物的敏感性,增强治疗效果,提高胃癌生存率。近年来,中医药抗肿瘤作用机制的研究成为研究热点,并在临床应用中疗效显著,因此,以中医药调节细胞焦亡作为切入点可能是未来治疗胃癌的新方向。基于上述研究,该文总结了细胞焦亡关键蛋白与胃癌发生、发展的作用机制,归纳了中药复方及中药活性成分通过介导细胞焦亡通路,减轻胃黏膜损害,降低胃癌发生率,以及预防肿瘤转移与复发的作用,以期为今后探索细胞焦亡机制和中医药治疗胃癌提供新思路。

细胞焦亡及其在肝细胞癌中作用的研究进展

细胞焦亡是一种新的细胞程序性死亡方式,在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病机理中起双重作用:一方面,引起细胞焦亡的炎症小体以及焦亡过程中释放的炎性介质会促进肝癌的发生发展;另一方面,焦亡可抑制肝癌细胞的增殖、转移和侵袭。随着研究的深入,细胞焦亡在肝癌中的作用越来越突出。本文就细胞焦亡在HCC进展过程中的潜在影响以及在抗癌治疗中的作用作一综述。

基于细胞焦亡途径探讨生骨再造丸对激素性股骨头坏死影响的作用机制

目的探讨生骨再造丸通过干预细胞焦亡对激素性股骨头坏死影响的作用机制。方法随机抽取10只雄性新西兰大白兔作为空白组,余30只采用微量内毒素(LPS)联合甲泼尼龙的造模法建立激素性股骨头坏死模型,造模成功后采用随机数字表法将其随机分为模型组、生骨再造丸组。空白组和模型组以等量生理盐水灌胃,连续干预4周,观察各组新西兰大白兔一般情况,给药结束后,采用苏木素-伊红(HE)染色观察股骨头组织病理变化;免疫荧光(IF)及免疫印迹法(Western blot)检测股骨头组织中Nod样受体蛋白3(NLRP3)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、胱天蛋白酶-5(Caspase-5)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)法检测股骨头组织中消皮素D(GSDMD)mRNA表达水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测股骨头组织中白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)的含量。结果与空白组相比,模型组兔精神状态差,倦卧懒动,毛色暗淡,活动减少,下肢跛行,股骨头组织病理形态学病变明显,股骨头组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-5、GSDMD蛋白表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01),股骨头组织中GSDMD、IL-1β、IL-18mRNA表达水平显著升高(P<0.05),股骨头组织中炎症因子IL-1β、IL-18含量显著上升(P<0.05)。与模型组相比,药物组兔精神状态明显好转,病理形态学病变程度明显改善,股骨头组织中NLRP3、Caspase-1、Caspase-5、GSDMD蛋白表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01),股骨头组织中GSDMD、IL-1β、IL-18mRNA表达水平显著降低(P<0.05),股骨头组织中炎症因子IL-1β、IL-18含量显著下降(P<0.05)。结论生骨再造丸可有效改善激素性股骨头坏死兔股骨头组织病理形态学改变,其机制可能与调控焦亡因子的表达,抑制细胞焦亡水平,起到延缓激素性股骨头坏死病程进展的作用。