鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和应用

为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒（DTMUV）抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku.Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法.采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件.重组抗原最适包被浓度为5 μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑.该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21％～7.27％和3.4％ ～7.2％,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性.用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3％.

登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ区的表达及其免疫反应性鉴定

目的在大肠埃希菌中表达登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ结构域,并进行免疫反应性鉴定。方法用C6/36细胞培养病毒,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增获得目的基因片段D2E-DⅢ。双酶切D2E-DⅢ和表达质粒pET-30a(+),经回收纯化后连接构建重组质粒pET30a-D2E-DⅢ。筛选阳性菌落,提取质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和Western blot鉴定。结果 RT-PCR扩增得到约300bp的目的基因片段D2E-DⅢ,双酶切鉴定重组质粒pET30a-D2E-DⅢ位置正确,经测序分析表明插入序列及开放读码框正确。经15%分离胶SDS-PAGE电泳分析,重组菌在相对分子质量为10×103附近有明显的诱导表达带,其大小与预测值一致;Western blot结果显示重组蛋白与确诊登革热Ⅱ型阳性血清存在特异性反应。结论成功地在大肠埃希菌中表达登革Ⅱ型病毒E蛋白DⅢ区,并进行免疫反应性鉴定,结果显示其具有良好的免疫活性。