D^(el)红细胞膜表面D抗原表位及抗原强度分析

目的分析Del红细胞膜表面D抗原表位并测定其抗原强度。方法采用16种针对D抗原不同表位的单克隆抗体,通过吸收放散方法检测74例Del个体红细胞膜表面D抗原表位,应用流式细胞术检测其相对抗原强度。结果 74例Del个体D抗原1~9表位检测均为阳性,D阴性、Del及D阳性红细胞相对D抗原阳性率分别为(0.97±0.18)%、(3.06±0.31)%和(99.65±0.71)%,3种表型红细胞D抗原平均荧光强度分别为13.89±2.45,24.18±3.38,223.32±13.05。结论 Del红细胞膜表面D抗原表位表达基本完整,其D抗原强度极低,仅含有微量的抗原分子数目。

Rh阴性孕妇血型D抗原同种免疫反应研究

目的研究Rh阴性孕妇血型D抗原同种免疫反应,为建立有区别的D亚型的输血规则提供参考。方法对RhD阴性孕妇进行基因分型,并检测是否有抗-D;总结分析孕妇妊娠次数以及胎儿红细胞的检出与产生抗-D之间的相关性。结果在122名RhD表型阴性的孕妇中,检出d/d基因型97例,Del型20例,弱D15型1例,RHD-CE(2—9)-D/d融合基因型3例,DⅥⅢ型1例。在97名RhD阴性(d/d)孕妇中,有38例产生抗-D;20名Del血型孕妇均未检出抗-D;3名RhD-CE(2—9)-D/d中有2例产生抗-D;1名弱D15型的孕妇未检出抗-D;1名DⅥⅢ型孕妇抗-D检出阳性。统计分析表明孕妇的妊娠次数以及外周血中检出胎儿红细胞的检出与抗-D的产生有相关性,这可以成为Rh阴性孕妇被D抗原免疫的证据。结论不同D亚型的个体可能会对D抗原有不同的免疫反应,我们认为在中国Del血型的受者可以接收D阳性血液。建立有区别的输血规则可以节约有限的Rh阴性血资源和提高输血安全。

RhD抗原表达与CE抗原的关系研究分析

目的探讨D抗原表达强弱与RhCE抗原的关系。方法采用微量板法对RhD阳性献血者检测Rh表型;抗球蛋白卡式法初筛RhD阴性标本进行确认并分型;吸收放散试验对经抗球蛋白法确认为RhD阴性标本进行Del表型筛选。结果 D抗原在Rh表型不同时与抗体的凝集强度的平均值有差别,测得的D抗原凝集强度从强到弱依次为DccEE>DCCee>DccEe>DCcEe>DCcee,各表型之间抗原凝集强度存具有统计学意义(F=2.945,P<0.05);不同D表现型的RhCE表型构成是不同的,具体表现为一般D阳性与RhD阴性相比,前者C、E抗原所占比例较大,后者c抗原所占比例较大,弱D和Del型这2种特殊D阳性则表现在,C、c、E抗原比例介于两者之间。结论RHCE基因形成的抗原组合影响RHD基因表达D抗原,Cc,cc抗原组合的标本可能出现D凝集强度减弱或者极弱形成弱D或者Del型,甚至D抗原不表达形成D阴性。

流式细胞术检测弱表达D抗原的探讨

曾有报道采用流式细胞术定量分析红细胞膜D抗原密度(D antigen density),为此提出采用敏感的流式细胞术常规检测D抗原弱阳性表型,本研究旨在探讨其可行性。2010年至2011年间采用盐水法、间接抗人球蛋白试验(IAT)和吸收放散试验检测到6例D抗原弱阳性表型和7例DEL型样本,通过RHD基因定型、合子型分析和RHD基因序列测定,鉴定3例为弱D15型,3例为部分DVⅠ-Ⅲ型,7例为DEL型且均携带RHD1227A等位基因。取正常RhD阴性2例和正常Rh(D)阳性样本2例作对照,采用流式细胞术分别检测上述弱D15型、部分DVⅠ-Ⅲ型和DEL型,观察其平均荧光强度。结果表明,流式细胞术检测弱D15和部分D型DVⅠ样本的平均荧光强度与Rh(D)阴性对照有显著性差异(P<0.05),可判读为D抗原阳性;7例DEL红细胞样本的平均荧光强度与Rh(D)阴性对照均无显著性差异(P>0.05),检测结果均可判读为阴性,其中包括1例DEL,其红细胞样本的吸收放散检测结果为强阳性,即使IAT检测的结果也显示为"±",合子型分析显示为RHD+/RHD+纯合子,流式检测亦为阴性。结论:流式细胞术检测D抗原的敏感度与IAT相近,低于吸收放散试验;用于检测弱D或部分D型不如IAT简便实用,用于检测DEL型其敏感度不够。

弱D15红细胞膜D抗原表位测定

目的分析弱D15型个体的红细胞膜表面的D抗原的表位情况。方法采用间接抗球蛋白试验通过12种抗D抗原不同表位的人抗-D单克隆抗体,检测2名通过基因测序确认的已知弱D15型个体的红细胞膜D抗原表位,分别以Rh阳性、Rh阴性作为对照。结果弱D15型个体的红细胞膜D抗原12个抗原表位中有7种检测为阳性,5种检测为阴性。结论弱D15型个体红细胞膜D抗原除分子数量减少外,还存在"质"的变化,提示其可能具有"部分D"的抗原特性。

RHD1227A型弱D的D抗原表位分析

目的分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型。对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位。结果血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde。3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与Rh(D)阳性对照样本相同。结论发现3例RHD1227A型弱D型;不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关。

高效价抗-D致双胎新生儿D抗原遮蔽合并HDFN 1例

目的分析1例Rh D阴性母亲高滴度抗-D致双胎新生儿D抗原遮蔽血清学特点,并讨论双胎新生儿发生HDFN的救治。方法采用微柱凝胶法及盐水法、热放散试验等检测血型,采用微柱凝胶技术检测父亲、母亲、大婴、小婴的不规则抗体、抗体鉴定及抗体效价。结果父亲、母亲、大婴、小婴的ABO血型和Rh分型分别为B、d CCee;B、DCc Ee;O、DCc Ee;B、DCc Ee,大婴、小婴RHD基因检测结果均为RHD/d(阳性),母亲及大婴、小婴抗体筛查均为阳性,抗体鉴定结果显示血清中均存在抗-D,母亲产前、产后抗体效价均为1024,大婴、小婴经及时输血换血治疗病情得到控制。结论母亲高滴度抗-D可导致新生儿D抗原完全遮蔽,在临床检测过程中需采用多种血清学方法及基因检测验证此类现象,避免误判血型结果。对产前Rh D阴性和特殊情况的孕产妇进行抗体筛查和鉴定,对其新生儿可能发生HDFN的输血换血救治具有非常重要的意义。

抗-D抗原决定簇互补区多肽遮蔽RhD抗原的效果

目的建立抗-D抗原决定簇互补区(CDRs)多肽遮蔽Rh D抗原的方法,并对遮蔽效果进行评价。方法根据抗-D CDRs氨基酸残基顺序合成多肽,使用流式细胞术检测红细胞表面Rh D抗原在多肽遮蔽前后的荧光强度;荧光显微镜下观察多肽与Rh D抗原的结合情况;使用在线分析工具对有效多肽进行理化性质及二级结构分析。结果不同多肽对Rh D抗原的遮蔽效果有较大差异,其中3号多肽遮蔽效果较理想,荧光强度显著降低。结论抗-D CDRs多肽可有效遮蔽Rh D抗原。

脊髓灰质炎病毒2型和3型D抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备脊髓灰质炎病毒2型(PV2)和3型(PV3)D抗原的单克隆抗体(mAb),并对抗体的特性进行初步鉴定。方法以PV2及PV3的D抗原为免疫原,常规方法制备小鼠源性mAb,用间接ELISA检测小鼠腹水效价、型别特异性及与C抗原的交叉反应。结果获得4株PV2特异性并与PV2的C抗原不交叉的mAb,2株PV3特异性并与PV3的C抗原不交叉的mAb。结论成功制备了PV2及PV3特异性并与C抗原不交叉的D抗原mAb。

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原 E2 囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位--B/C 抗原区和 A/D 抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒 E2 蛋白的 A/D 抗原区基因, 并将 PCR 产物克隆入含有强启动子 PAOX1和α-MF 信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体 pPICZαC 中,构建成重组质粒 pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母 X33菌中,经 ZeocinTM筛选得到 5 株高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS-PAGE 和 Western blot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的 E2 蛋白,蛋白表达量达 175.8μg/mL。N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化。该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础。

Rh血型D抗原弱表现型基因分型和序列分析

目的 探讨 Rh血型 D抗原弱表现型 D抗原数目和 (或 ) D抗原表位数减少形成的分子基础。方法 常规 PCR技术检测 3名 D抗原弱表现型非血缘关系个体 D基因的第 4内含子 ,多重 PCR技术分析第 3、第 6和第 9外显子 ,并分别对 3名个体的 D基因部分序列进行分析。结果 3名 D抗原弱表现型个体 D基因第 4内含子 ,第 3、第 6和第 9外显子检测结果与正常 D基因完全一致 ,部分序列分析未发现基因突变和 D/CE基因交换。结论 D抗原数目和 (或 ) D抗原表位数的减少造成其血清学弱表现型可能与

126例Rh阴性妇女D抗原刺激后血清抗体分析

目的探讨Rh阴性妇女生产Rh阳性胎儿后血清抗体产生的规律。方法通过对126例妊娠后期的孕妇或已生产过的Rh阴性妇女（包括流产史者）进行血清学Rh抗体的测定及致病性分析。结果Rh阴性妇女怀孕Rh阳性胎儿一胎、二胎、三胎其抗-D产生的发生率分别为20．31％（13／64），35．71％（10／28），82．35％（28／34）；新生儿溶血病发病率与其母亲体内血清抗体效价成正相关；产前是否常规检查Rh血型及抗体筛查对预防Rh新生儿溶血病有明显的作用。结论D抗原刺激的频率与血清抗体的产生具有明显的相关性，对Rh阴性孕妇产前测定抗-D抗体可以有效预防新生儿溶血病的发生。

直抗阳性患者Rh血型D抗原的鉴定

目前在人红细胞上已经发现了30个血型系统，Rh血型系统是其中最具复杂性和多态性的血型系统之一，同时在临床输血上其重要性仅次于ABO血型系统。而在Rh血型系统的50多个抗原中，D抗原又是最为重要的1个血型抗原，因能引起溶血性输血反应而备受重视。

D抗原定型和抗体筛检1859例

D抗原是仅次于A、B抗原的最重要的红细胞抗原,在临床上具有重要意义。检查受血者与供血者之间在D抗原方面相合情况及检测可导致溶血性输血反应的血型抗体,是确保安全输血的重要措施。我们自1993年7月对需输血患者作D抗原定型和抗体检测,现将结果报告如下。

RHD mRNA剪接体与RhD抗原表达的相关性及其在输血及妊娠中的免疫应答研究

目的通过探讨RHD mRNA剪接体多态性与RhD抗原表达的强度在临床输血、妊娠中的异常免疫应答,为RhD血型定型标准与输血原则提供理论依据。方法选择案例1:RhD阳性(血清学凝集强度达4+)的男性患者因为多次输RhD阳性血合并自身免疫性疾病,血浆中产生了抗-D。案例2:RhD弱阳性孕妇怀孕RhD阳性胎儿产生了抗-D。案例3:Rhccdee表型的地贫患儿因长期(8年)输注常规定型为RhD阴性的血液后产生了抗-D。以上3例样本提取全血的mRNA通过反转录成cDNA,使用RT-PCR法通过自主设计的引物进行扩增测序与分析RHD mRNA剪接体的多态性结构。结果所选的3例患者中患者1、患者2均以3种剪接体的多态性表达了RHD基因。患者1的RHD mRNA剪接体形式:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,并且在exon-3的第426位发生C>A突变、exon-5的707位发生A>G突变、713位发生T>C突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;患者2的RHD mRNA剪接体:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-8,9,未发现其他核苷酸突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;因为患者3是RhD阴性,缺失RHD基因全部外显子,因此未检测到RHD mRNA剪接体的多态性。结论 RhD抗原的表达直接受RH基因调控,RhD mRNA剪接体的多态性决定RhD抗原强度的差异。RhD抗原弱阳性或阴性的受血者在接受RhD阳性血液时也受同种异体免疫产生抗-D的风险。

酸放散方法对弱D抗原的筛选研究

目的目的确定用盐水抗D检测为D阴性的红细胞标本中是否存在Del型红细胞标本。方法将待检红细胞样本与人血清抗D抗体混合吸收。采用酸放散方法将致敏在红细胞上的抗D抗体放散下来,用微柱凝胶抗人球蛋白试剂卡及试管法检测放散液中是否存在抗体。结果51份由盐水抗D确定为D阴性的红细胞样本中有3人用传统试管法抗人球蛋白实验检测为弱凝集;经酸放散实验后,检测放散液,此3人放散液中均存在较强的抗D抗体,以此确定此3人红细胞抗原为Del型。结论酸放散实验在临床输血中可做为确定红细胞上是否存在弱D抗原的敏感方法。

猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原域在毕赤酵母中的表达

对含猪瘟病毒E2蛋白A/D抗原区基因插入的重组酵母菌株进行诱导表达,通过对诱导时间、重组酵母菌株、菌体密度、培养液pH、甲醇剂量等培养条件与表达产量关系的分析,对重组蛋白的表达条件进行了优化。优化后的条件为:28～30℃,225r/min振荡培养至BMGY中菌体OD600值为3.0～3.5时,将菌体转入相当于4倍体积BMGY,pH为6.0的BMMY培养基中培养72h,每24h加入甲醇至终浓度为总体积的0.5%～1.0%。在此优化条件下,重组蛋白的表达量可达275.38μg/mL,比较温度对重组蛋白降解率的影响后发现,培养物上清液应保存于-20℃。

自动化液体处理工作站在脊髓灰质炎疫苗D抗原含量检测中的应用

目的用自动化液体处理工作站代替人工进行脊髓灰质炎疫苗的D抗原检测。方法用自动化液体处理工作站检测10批脊髓灰质炎疫苗的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原,通过与人工操作的检测结果比较分析其准确性;通过对6批疫苗的6次试验内和3次试验间平行检测验证其精密性。结果工作站与人工操作的检测结果差异均无统计学意义(P>0.05),且工作站与人工操作的结果具有相关性(P<0.05),两种方法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原检测结果的Pearson相关系数分别为0.7,0.7,0.9。对于工作站的试验内精密性,几何变异系数不高于8%;对于试验间精密性,几何变异系数不高于9%。结论自动化液体处理工作站操作的准确性和精密性良好,能够代替人工完成脊髓灰质炎疫苗D抗原含量检测。