由D型氨基酸设计自组装短肽D-EAK16构建新型三维纳米纤维支架材料

采用D型氨基酸设计自组装短肽D-EAK16,运用圆二色仪及原子力显微镜等仪器和细胞三维培养,发现短肽D-EAK16在30℃时具有稳定的二级结构β-sheet,在一定浓度下D-EAK16可形成由纳米纤维构成的透明水凝胶,含水量高达99%,可在细胞培养基(如PBS,DMEM)中形成支架.细胞三维培养显示,该水凝胶对细胞HO-8910和SPC-A-1的生长未见毒性.比较D型氨基酸纳米支架和L型氨基酸纳米支架,细胞的毒性未发现显著性差异.采用D型氨基酸构建的自组装短肽,可提供一个三维基质培养系统,期望能广泛应用于生物医学工程等领域.

柞蚕抗菌肽D杀菌机理研究

本文研究柞蚕抗菌肽D对水稻白叶枯病细菌及番茄、烟奇、马铃薯青枯病细菌的杀菌作用及其机理。在37°C,pH6.8条件下,最低有效剂量2ng/1×10~5活菌。通过电镜观察,抗菌肽D对大肠杆菌及白叶枯病细菌的作用,首先使其外壁层及细胞质膜损伤,尤以菌体两端更为明显。此后形成喇叭状缺口,内容物呈囊状挤出胞外而致死。抗菌肽作用的菌体表面形成微管通道,钾离子大量渗出,但菌体外形在短时间内不致崩坏。

人工合成柞蚕抗菌肽D基因转化沙田柚

采用根癌农杆菌介导法将柞蚕抗菌肽Ｄ基因导入沙田柚上胚轴等外植体，经卡那霉素筛选，获得了若干转基因植株对这些植株进行胭脂碱电泳检测、点印迹杂交、ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。

转抗菌肽D烟草对土壤微生物群落的影响

采用RAPD分子标记技术研究了种植转抗菌肽D烟草的土壤环境中微生物群落遗传多样性的变化,同时用传统平板培养法研究了土壤中可培养微生物在数量上的变化。RAPD分析结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围微生物的遗传多样性相关指数并没有显著差异。培养计数结果表明,转抗菌肽D烟草与非转基因烟草根围可培养细菌在数量上有极显著差异,可培养真菌数量有显著减少,可培养放线菌的数量没有显著差异。说明转抗菌肽D烟草可能抑制了病原细菌及其根围相关的微生物,但是不影响微生物的遗传多样性。

柞蚕杀菌肽D对人直肠癌细胞的杀伤作用及机制

柞蚕杀菌肽D在0．05～200μg／mL浓度范围内对直肠癌细胞的生长有明显抑制作用；用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）对癌细胞的掺入试验，发现能抑制细胞DNA的合成．导致3H-TdR掺入率明显下降。钙离子螯合剂Indo-1-AM能与癌细胞内钙离子螯合而产生特异性荧光，通过粘附细胞激光定量分析及筛选议的观察，发现杀菌肽能破坏细胞的钙离子通道，钙离子迅速逸出细胞外。采用电子显微镜观察直肠癌细胞超微结构的变化，发现杀菌肽首光破坏细胞膜致微绒毛收缩、融合，继而导致细胞器的破坏，最终细胞崩解死亡。正常猴肾细胞CV1，在1.00μg／mL浓度杀菌肽D作用48h，尚未发现不良影响。

抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定

用花粉管通道法将柞蚕抗菌肽D基因导入番茄 ,获得了转基因植株。应用PCR技术、DNA斑点杂交以及South ern印迹分析表明 ,抗菌肽D基因已整合到番茄基因组 ;而且 ,位于目的基因下游的胭脂碱合成酶基因有表达。青枯假单孢菌活体接种结合高发病大田种植试验结果显示 ,部分转基因植株的子一代具有较强的抗青枯病能力。

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞 .再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中 .在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中 ,共培养介质中的乙酰丁香酮 (As)能显著提高其转化效率 ,与对照相比 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从 0提高到 0 .75 .悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响 ,共培养 1、2、3d后 ,每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为 0 .2 0、0 75、0 .

柞蚕杀菌肽D对宫颈癌细胞系和阴道毛滴虫生长的损伤作用

柞蚕等昆虫在某些理化因素诱导下,可产生杀菌肽。该物质不但具有广谱杀菌作用,且对某些原虫和癌细胞有抑制作用。为了把杀菌肽的应用引入临床,本文研究了柞蚕杀菌肽D对宫颈癌细胞(SiHa细胞)及阴道毛滴虫的影响,并探讨其机理。

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。

几丁质酶和抗菌肽D双价基因转化茄子的研究

在建立茄子的组织培养及遗传转化体系的基础上，以根癌农杆菌为介导，采用叶盘法将几丁质酶和抗菌肽Ｄ双价基因转入茄子，分别获得６株ＫａｎＲ植株。对ＫａｎＲ植株进行点杂交、ＰＣＲ扩增等分子检测。结果表明，目的基因已整合进茄子核基因组中。

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。

柞蚕抗菌肽D基因转化广藿香的研究

结果表明，柞蚕抗菌肽Ｄ（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ）对广藿香青枯病的病原细菌ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＳｏｌａｎａｃｅｒｕｍ有很强的抑制作用。通过农杆菌介导的方法将Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｄ基因导入广蕾香细胞，获得５株转基因植株，并繁殖成无性系。５个无性系在与病原菌共培养时都表现出一定的抗性。

载脂蛋白A-I模拟肽D4F通过抑制caspase-12减轻氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞凋亡

目的:探讨载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,Apo A-I)模拟肽D4F对氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)诱导的巨噬细胞凋亡和内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)凋亡途径关键分子caspase-12的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:体外培养RAW264.7巨噬细胞,给予12.5、25和50 mg/L D4F、5 mmol/L ERS抑制剂4-苯丁酸(4-phenylbutyric acid,PBA)或5μmol/L二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium,DPI)预处理1 h后,再加入100 mg/L ox-LDL或4 mg/L ERS诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)继续培养24 h。MTT法检测细胞活力;TUNEL法检测细胞凋亡情况;试剂盒测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性;Western blot法检测caspase-12的表达变化。结果:与ERS抑制剂PBA相似,D4F可抑制ox-LDL或TM所致的巨噬细胞活力降低和凋亡,且呈浓度依赖性(P<0.05)。与氧化应激抑制剂DPI相似,D4F显著抑制ox-LDL诱导的氧化应激反应,表现为ROS和MDA生成减少(P<0.01)、SOD活性增加以及NADPH氧化酶活性降低(P<0.05);与PBA和DPI相似,D4F可减轻ox-LDL诱导的巨噬细胞caspase-12活化,且呈浓度依赖性(P<0.05);另外,D4F还可抑制TM诱导的caspase-12活化(P<0.05)。结论:D4F能够抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡,其机制至少部分是通过减轻氧化应激继而抑制caspase-12活化实现的。

柞蚕杀菌肽D对宫颈癌SiHa细胞生长的损伤作用

柞蚕杀菌肽Ｄ对宫颈癌ＳｉＨａ细胞生长的损伤作用韩献萍，彭朝晖，涂冰，刘连璞，杨光彩柞蚕等昆虫在创伤，注射细菌，用化学物质或超声处理，热振荡、γ－射线照射等生物、理化因素作用下，可被诱导产生杀菌物质。１９７２年，Ｂｏｍａｎ［１］将其命名为杀菌肽。研究表...

柞蚕抗菌肽D转基因酵母的培养及表达产物的分析

采用碱金属法（醋酸锂盐），以大肠杆菌－酵母穿梭质粒表达载体在酵母中表达人工合成的柞蚕抗菌肽Ｄ基因。用电泳及抗菌肽活性检测法对表达产物进行分析。同时还研究了转基因酵母的发酵条件，如温度、ｐＨ及营养等对酵母表达的影响。试验结果表明转基因酵母表达产物为１．１４ｍｇ／Ｌ培养液，杀菌活力为０．２１６单位。

人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表达

为了获得高效表达的抗菌肽D2A21,本研究根据抗菌肽D2A21的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成D2A21基因,并将该合成基因克隆至pProEXHTb载体中,构建成含有含6个组氨酸标签的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌中,经摇瓶发酵,IPTG诱导后,发酵液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明,成功合成D2A21基因,并构建了抗菌肽D2A21表达载体。通过镍柱亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,抗菌肽D2A21能够在大肠杆菌中稳定表达。本研究将为大规模表达纯化D2A21及其进一步的研究和利用提供一定基础。

冠心病患者血浆D型利钠肽水平变化

目的:研究冠心病患者血浆D型利钠肤(DNP)浓度的变化,探讨其在冠心病发生发展中的可能作用。方法:选取2013年7月至2014年4月福建医科大学附属协和医院因胸痛住院并行冠脉造影的患者,所有病例按照冠脉造影结果分为冠心病组和对照组,每个病例根据冠脉造影结果计算Gensini评分代表冠脉病变严重程度。ELISA测血浆DNP,环磷酸鸟苷(cGMP)及中性内肤酶(NEP)浓度。结果:共收集符合纳入标准的冠心病患者48例,冠脉造影冠脉正常者45例作为对照组。冠心病组血浆DNP水平高于对照组[(5060±1870)pg/mL vs(4250±1270)pg/mL,P<0.05];而冠心病组血浆cGMP、NEP浓度与对照组比较无统计学差异(P>0.05);不同类型冠心病组间DNP浓度没有统计学差异(P>0.05)。冠心病组血浆DNP浓度与Gensini评分进行Pearson相关性检验,二者间没有明显相关(r=0.105)。以是否冠心病为因变量,DNP、N端脑钠肤前体(NT-proBNP)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)及左室射血分数(LVEF)值为自变量进行Logistic回归分析示:DNP、NT-proBNP及hs-CRP与冠心病阳性率存在正相关,而LVEF值与冠心病阳性率存在负相关。结论:冠心病患者血浆DNP浓度升高,可能在冠心病发生与发展过程中起一定作用。

转抗菌肽D基因中华猕猴桃的鉴定及抗病性相关酶活性研究

以转抗菌肽D基因的中华猕猴桃抗性芽为材料,通过诱导生根和移栽获得猕猴桃盆栽苗。对盆栽苗进行PCR和RT-PCR鉴定表明,抗菌肽D基因已经整合到猕猴桃基因组中,并进行了转录。对盆栽苗叶片中的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性分析结果表明,在喷施猕猴桃细菌性溃疡病病原菌（1.2×10~7~1.2×10~8,OD600值为0.2）的条件下,转基因植株的CAT和POD活性比未转基因植株明显降低,PAL活性比未转基因植株明显升高。

柞蚕抗菌肽D中精氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸残基的化学修饰

用不同的化学试剂修饰了柞蚕抗菌肽D分子中的色氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸残基。NBS修饰抗菌肽D,以及氨肽酶M对抗菌肽D作用的结果表明色氨酸残基对抗菌肽D抑制E.coli D31的作用影响不大。CHD和MLH对精氨酸和赖氨酸残基的修饰,导致抗菌肽D失去抑制E.coli的作用,但可逆地消除CHD和MLH的修饰作用后,抗菌肽D恢复了对E.coli D31的抑菌作用。这些结果初步认为,抗菌肽D抑菌作用与分子中的荷电性有关,改变了分子的电荷,也就同时失去了其抑菌功能。 此外,对精氨酸残基修饰的结果还表明,抗菌肽D的免疫原性与精氨酸残基有关。但是,抗菌肽D的免疫决定簇与其生物活性中心并不完全平行。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因及抗菌肽D基因双抗表达载体的构建

选取分别被克隆到Ｃｏ２４质粒和ＢＳ质粒上的番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ—ＣＰ）基因和柞蚕抗菌肚Ｄ（ＣｅｃｒｏｐｉｎＤ）基因为材料，构建了单抗表达载体ＦＫ３和ＰＣｏ２５，进一步构建了双抗植物表达载体ｐＫＰＴ。这为开展单抗和多抗植物基因工程的研究提供了重要途径。