绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌的生物学特性及2种候选疫苗的免疫效果评价

旨在研究新疆绵羊源荚膜血清D型多杀性巴氏杆菌(PmD)的生物学特性,探索其灭活疫苗与OmpH重组疫苗对小鼠的免疫保护效果,为防控新疆地区绵羊巴氏杆菌病提供参考。采用细菌分离鉴定、PCR鉴定、药敏试验、耐药与毒力基因检测、致病性试验等方法初步明确PmD的生物学特性;并通过最佳灭活条件和佐剂筛选、安全性试验、原核表达等方法制备PmD灭活疫苗与PmD-OmpH重组疫苗,采取小鼠攻毒保护试验评价2种疫苗的免疫效力。结果:从绵羊肺脏中分离出1株PmD,药敏试验显示,该菌为7重耐药菌,未检测到耐药基因;毒力基因检测显示,该菌具有12种毒力基因(exbB、exbD、hgbA、tonB、fimA、Oma87、OmpH、Psl、sodA、sodC、tbpA、toxA);致病性较强,对小鼠的最小致死菌量为2.2×105 CFU;灭活疫苗和重组疫苗对相同血清型菌株攻毒的保护率分别为80%和10%;灭活疫苗对血清型A、F和未知菌株攻毒保护率分别为0、20%和0,而重组疫苗的保护率则全为0。本研究发现1株强耐药、强毒力的绵羊源PmD,灭活疫苗对同种血清型菌株的保护性远高于重组疫苗,发病地区羊场可采用同种血清型灭活疫苗进行预防和控制绵羊巴氏杆菌病,对多价疫苗和新型疫苗的研制还有待进一步发掘。

特定密度的3D打印补偿膜在乳腺癌放疗中的临床应用

目的:探究特定密度的3D打印补偿膜在乳腺癌放疗中的临床应用,并评估其对剂量分布和放疗摆位的影响。方法:随机选取行调强放疗的乳腺癌切除术后患者40例,使用3D打印补偿膜与常规补偿膜各20例,均采用发泡胶仰卧位固定。基于室内激光和体表标记进行常规摆位,每日Catalyst HD光学体表引导结合每周一次CBCT验证。记录不同补偿膜下的绝对剂量、患者皮肤表面剂量、手术切口、计划布野、靶区剂量(V_(CTV 50 Gy)、V_(PTV 50 Gy))和危及器官受量,并计算适形度指数和均匀性指数;同时,记录患者的CBCT及Catalyst HD摆位误差。结果:不同补偿膜下的绝对剂量差异无统计学意义(P>0.05),3D打印补偿下的皮肤表面剂量显著高于常规补偿(P<0.05),二者分别为(54.83±0.44)Gy和(54.43±0.51)Gy。使用3D打印补偿膜的患者较常规补偿膜的适形度指数更高,二者分别为0.69±0.04和0.65±0.02。基于不同补偿膜,V_(CTV 50 Gy)差异无统计学意义(P>0.05),3D打印补偿膜的患者V_(PTV 50 Gy)略低于常规补偿膜,且危及器官受量更低(P<0.05),心脏Vmean分别为9.68%±3.24%和11.43%±3.60%。3D打印补偿膜的患者中,计划布野及手术切口对靶区剂量均存在影响,不包内乳的靶区剂量较包内乳更大(P<0.05)。当布野不包内乳时,不同手术切口仅对V_(PTV 50 Gy)存在影响,且横梭形较斜竖形切口的V_(PTV 50 Gy)更高(P<0.05),二者分别为95.58%±0.51%和95.44%±0.71%。3D打印与常规补偿膜的光学监测误差仅在左右方向存在差异,分别为(0.08±0.57)cm和(-0.15±0.46)cm(P<0.05)。结论:与常规补偿膜相比,3D打印补偿膜可提高剂量分布和光学监测误差;同时3D打印补偿膜下的手术切口和计划布野对靶区剂量均存在一定影响。

3D膜解剖理念在腹腔镜腹膜外入路根治性膀胱切除术中的初步应用

目的探讨基于3D膜解剖理念的腹腔镜腹膜外入路根治性膀胱切除术的临床可行性。方法回顾性分析2020年10月至2021年6月于安徽医科大学第二附属医院行3D腹腔镜腹膜外入路根治性膀胱切除+回肠原位新膀胱术的10例膀胱癌患者的临床资料。均为男性,中位年龄67(53~79)岁;美国麻醉医师协会评分1~2分8例,3分2例;有吸烟史6例;合并高血压病4例,糖尿病2例,心脏病1例;均无腹盆部手术史。术中基于3D膜解剖理念对盆腔内重要筋膜进行识别定位,即由膀胱前筋膜平面分离到达膀胱侧间隙,并与Retzius间隙、Bogros间隙汇合,在膀胱前筋膜、膀胱腹下筋膜和尿生殖筋膜包绕形成的层面内解剖以完成膀胱切除过程。结果所有患者手术均顺利完成,无中转经腹腔途径或开放手术;术中无腹膜损伤。手术时间中位值276(237~325)min,术中失血量中位值160(50~280)ml;术后肠道功能恢复时间中位值1.8(1~3)d,术后下床活动时间中位值1.3(1~2)d,术后住院时间中位值9(5~12)d。所有患者淋巴结清扫数量中位值10(6~20)枚,淋巴结阳性3例,10例切缘均为阴性;术后病理分期T_(2b)N_(0)期5例,T_(2b)N_(1)期2例,T_(3a)N_(0)期2例,T_(3b)N_(1)期1例。中位随访6(2~10)个月,所有患者均无严重并发症。结论在腹膜外入路根治性膀胱切除术中运用3D膜解剖理念识别定位关键的筋膜结构与层面切实可行,术中解剖清晰,可降低手术难度;手术相关并发症少,术后恢复较快。

D膜植棉栽培模式的优势、应用效果及配套栽培技术

本研究以陆地棉‘新陆中67’为材料,研究D膜栽培模式对棉花生长发育、棉田地温、膜下积温的影响。试验结果表明:D膜植棉‘新陆中67’生育期比C膜提前成熟5~7 d。从苗期生育进程看,D膜栽培棉株果枝数比宽膜多1.9个,具有显著性差异;开花多0.7个,成铃数多0.6个,无显著性差异。株高和果枝数二者表现为显著性差异。D膜与C膜衣分、亩产、收获株数、亩铃数差异表现显著性。D膜的衣分比C膜衣分高1.6%,亩产增产11.37%。膜下温度相比,D膜明显要比C膜高。D膜植棉栽培技术具有较好的增温、保墒、杀虫、压草效果,对棉花产量提高、品质提升具有重要的意义。

跨膜4域亚家族成员6D基因敲除致雄性小鼠生育力降低实验研究

目的:探讨跨膜4域亚家族成员6D(Ms4a6d)基因敲除对雄性小鼠生育力的影响。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)鉴定小鼠基因型,将Ms4a6d^(-/-)雄鼠和野生型C57小鼠分别与同龄野生型雌鼠合笼交配,统计各组雌鼠怀孕产仔情况,收集睾丸组织,称重并计算器官指数,评估附睾尾精子数量、运动参数等变化情况,通过形态学分析和HE染色评估小鼠睾丸组织形态学变化,采用免疫荧光染色分析睾丸巨噬细胞变化。结果:Ms4a6d^(-/-)雄鼠子代数目显著低于WT雄鼠(P<0.05);Ms4a6d^(-/-)雄鼠睾丸体积及质量均减少(均P<0.05);Ms4a6d^(-/-)雄鼠附睾尾精子浓度下降(P<0.05),各项运动参数未见统计学差异(P>0.05);睾丸组织切片HE染色结果显示Ms4a6d^(-/-)雄鼠睾丸曲细精管直径及管腔厚度均明显减少,支持细胞、精原细胞、初级精母细胞及精子细胞均减少;免疫荧光结果显示Ms4a6d^(-/-)雄鼠睾丸巨噬细胞受到影响。结论:Ms4a6d基因敲除干扰了雄性小鼠睾丸的发育,并造成生精小管直径减少、厚度变薄,附睾尾部精子数量显著下降,从而使成年雄鼠的生育力显著下降。

Eudragit NE30D膜的制备及其性能参数的标准化研究

目的考察Eudragit NE30D膜的制备条件,探索膜性能参数的标准化方法。方法分别使用质量分数5%、7.5%、10%、12.5%、15%的Eudragit NE30D水分散液,考察了1、2 mL两种体积和25、40、55℃温度对Eudragit NE30D膜制备的影响,比较了其厚度、均匀度、表面平滑度、含水量、透湿量、抗张强度、断裂伸长率。结果 Eudragit NE30D适宜的成膜温度为40℃,成膜时间4～6 h,操作体积为1 mL,质量分数为5%～10%,控制含水量5%。制得的膜标准化参数、透湿性和机械性能的重现性良好。结论本法简单可行,为研究Eudragit NE30D性能提供参考。

D型产气荚膜梭菌ε毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从D型产气荚膜梭菌标准株(C60-2)染色体DNA中扩增出ε毒素基因。该基因产物大小为906bp,序列分析结果表明,与GenBank报道的产气荚膜梭菌参考菌株ε毒素基因序列同源性大于99%。将扩增的ε毒素基因定向克隆到原核表达载体pET32a中,得到重组质粒pET32a-ETX,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plys中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见大小为54ku的特异条带;经Western blotting和ELISA检测结果表明,表达的ε毒素能与抗天然ε毒素抗体发生特异性反应,说明ε毒素蛋白具有较好的反应原性。将表达的ε毒素蛋白用0.4%的甲醛溶液制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护力,这表明该重组菌株有望成为产气荚膜梭菌基因工程类毒素疫苗的候选菌株。

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症间接ELISA诊断方法的建立

根据菌体蛋白可以刺激机体产生相应抗体的原理,建立了以产气荚膜梭菌粗提菌体蛋白为抗原的检测牛D型产气荚膜梭菌抗体的间接ELISA。结果显示,D型产气荚膜梭菌菌体裂解抗原最适包被浓度为50μg/mL,最适包被条件为37℃1 h;被检血清的最适稀释度为1∶100,酶标二抗的最适工作浓度为1∶1 000,血清与酶标二抗的反应时间均为37℃1 h;最适封闭时间为37℃1 h;PBST稀释液中脱脂乳的浓度为30 g/L;底物最适反应条件为室温25 min;阴阳性临界值为0.032。对采集于吉林省延边州的100份牛血清样品采用建立的间接ELISA进行了检测;结果,阳性率为11.0%。经特异性试验、重复性试验和与琼脂扩散抗体检测法比较,采用裂解菌体蛋白为抗原建立的ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

D型产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

D型产气荚膜梭菌常引起新生羔羊痢疾和山羊、牛等家畜的肠毒血症,致死性强,对畜牧业造成很大的危害。ε毒素是D型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学的角度对该毒素的研究具有重要实际意义。论文主要对国内外关于D型产气荚膜梭菌ε毒素分子生物学结构与性质,ε毒素引起的家畜肠毒血症以及对其作用靶器官肾脏和脑组织破坏的致病机理进行了介绍,对国内外D型产气荚膜梭菌ε毒素预防措施进行了综述,为研究D型产气荚膜梭菌ε毒素结构与功能的关系以及预防治疗动物肠毒血症提供参考。

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症胶体金免疫层析检测方法的建立

分离体外培养的牛源D型产气荚膜梭菌参考株菌体抗原,甲醛灭活后加弗氏佐剂免疫家兔,获得兔抗牛源D型产气荚膜梭菌多抗,并对其进行纯化,用25 nm胶体金标记多抗制备金标探针,分别以兔抗牛源D型产气荚膜梭菌IgG和羊抗兔IgG作为硝酸纤维素膜上的检测线和质控线,组装胶体金试纸条,并对试纸条的检测效果进行评价。结果显示:试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果,对D型产气荚膜梭菌抗原具有高度特异性;试纸条在4℃保存6个月,其特异性及灵敏度没有明显变化。本研究建立的牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合用于牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症的现场检测及鉴别诊断。

牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症dot-ELISA诊断方法的建立

以纯化的菌体蛋白为诊断抗原,建立了牛D型产气荚膜梭菌特异性抗体的斑点酶联免疫吸附试验(dot-ELISA)检测方法,确定了各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1.95μg/mL,血清稀释度为1∶320,二抗稀释度为1∶2 000,封闭液为30 mL/L脱脂乳,抗原、血清、二抗和封闭液的作用温度及时间均为37℃30 min。用该dot-ELISA检测30份牛血清,纯化抗原比粗提抗原的阳性检出率高16.7%;dot-ELISA的灵敏度是琼脂免疫扩散试验(AGID)法的43倍;用dot-ELISA法对100份牛血清样本进行检测,阳性率为59.0%;经特异性试验、重复性试验和与AGID法比较,表明用纯化抗原建立的方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

D型产气荚膜梭菌最佳产毒时间及毒素大小的确定

本实验测定了D型产气荚膜梭菌在肝片肉汤培养基的生长曲线、培养液的pH值变化曲线以及不同培养时间提取的毒素液的蛋白质含量,并用SDS-PAGE电泳方法检测了所提毒素为α、ε毒素。结果表明,D型产气荚膜梭菌在肝片肉汤培养基培养18h是其α、ε毒素的最佳产毒时间,毒素大小分别是43kD、35kD。

D型产气荚膜梭菌引起青鹿猝死

对上海动物园 1头猝死的青鹿进行了详细的病原学研究。在死亡动物的肠组织中分离到粗大正直的杆菌 ,有荚膜和芽孢 ,并能使牛乳培养基海绵状发酵 ,可致死小白鼠 ,LD5 0 为 5× 1 0 4CFU。结合肠内容物的毒素中和试验、青鹿的临床症状和病理解剖特征 ,确诊该青鹿的猝死是由于感染了毒力较强的D型产气荚膜梭菌。

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒，其中RNA病毒为水疱性口炎病毒（VSV），DNA病毒为伪狂犬病毒（PRV），将两种指示病毒分别用于验证S／D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38－5.88和≥3.50－4.75logTCID50／0．1ml，表明S／D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。

D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析

研究D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点,试验设计特异性引物扩增ε毒素基因,目的基因片段大小为888 bp。建立PCR反应体系并设置反应条件,扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列,与参考序列进行同源比对分析。结果表明,目的基因扩增良好,分离菌株WC-epsilon-FL与菌株C60-3、NCTC 8346、Mukteshwar、AJ250956的核苷酸序列的同源性依次为99.9%、99.8%、98.9%、99.4%。

D型产气荚膜梭菌贵州分离株ε毒素的DNA序列测定与分析

为研究产气荚膜梭菌ε毒素的结构与功能,以及对该病的防治提供基础依据,利用D型产气荚膜梭菌贵州分离株（CP02株）,根据GenBank中登记的产气荚膜梭菌ε毒素基因设计特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考毒株进行相似性比较。结果表明：D型产气荚膜梭菌CP02株基因片段大小为456bp,与CWD_CN_409、NCTC_8533、NCTN_6121、ETX21512、KurCpD1、CtrCpD2、IVRI_Vac1和IVRI_49菌株的核苷酸序列相似性在98.5%~100%,推导的氨基酸序列相似性在98.4%~100%。碱基突变以A-G、C-T间的转换为主,也发生低频率的A-C、G-T间颠换,但突变均为点突变。

D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白结构及抗原表位分析

利用生物软件对D型产气荚膜梭菌ε毒素的蛋白结构、抗原表位进行预测与分析。综合ε毒素蛋白亲水性、表面可能性、抗原指数、二级结构预测结果显示,肽链13-19、44-47、59-63、79-82、94-97、151-153、200-204、211-221、245-250、257-260位可能存在B细胞抗原表位,三级结构预测的94、151结合位点位于94-97、151-153抗原表位区内。

3D打印和铸造用覆膜砂的性能及应用

对3D打印用覆膜砂和铸造覆膜砂分别进行了热抗拉强度、热抗弯强度、发气量和灼减量等性能测试,通过测试结果并结合两种覆膜砂的微观形貌、成分、用途以及工艺等,分析了二者的性能差异。结果表明:3D打印用覆膜砂的强度优于铸造用覆膜砂,但3D打印用覆膜砂的发气量和灼减量明显较高。原砂的角形系数对强度有很大影响,角形系数越小强度越高。相同粒度分布的原砂,其中细砂的含量越多其强度也越高。

关中奶山羊源D型产气荚膜梭菌全基因组序列测定及其分子特征分析

本研究自陕西省富平县某规模化关中奶山羊养殖场腹泻奶山羊肛门拭子中分离到5株产气荚膜梭菌,命名为21-D-1~21-D-5。毒素基因检测表明,其均为携带etx的D型产气荚膜梭菌,且21-D-5携带食源性致病毒素基因cpe。全基因组序列测定显示,5株D型产气荚膜梭菌基因组大小、GC含量和基因数量稳定;单核苷酸多态性(SNPs)分析显示,21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之间的SNPs差异极低(<25),表明其大概率属于相同的产气荚膜梭菌菌株。分离的D型产气荚膜梭菌基因组中共检测到15种毒素基因,其中,毒素基因etx在分离的D型菌株中高度保守、基因环境相似,且在菌株21-D-5中毒素基因cpe位于etx下游。此外,包括噁唑烷酮类耐药基因optrA在内的9种耐药基因也在分离株中被检测到,并且erm(A)、optrA和fexA具有共同传播的可能性。本研究为国内首次对D型产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定分析,结果对产气荚膜梭菌疾病的防治和基因组的进一步研究具有参考价值。

人参皂苷Rg3对骨质疏松大鼠骨代谢及肠钙吸收功能的影响

目的:探究人参皂苷Rg3对骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠骨代谢及肠钙吸收功能的影响。方法:60只SPF级雌性Wistar大鼠,按照随机数字法分为空白组、模型组、阳性组、实验组,每组大鼠各15只。除空白组外,其他大鼠均采用去势(OVX法)法制备OP大鼠模型。造模成功后,空白组及模型组生理盐水灌胃[10 mL/(kg·d)],阳性组给予阿仑膦酸钠维D3灌服(每周6.25 mg/kg),实验组给予人参皂苷Rg3[80 mg/(kg·d)]灌胃治疗,连续干预治疗12周。检测各组股骨、胫骨骨密度变化,酶联免疫法检测大鼠血清中骨保护素(osteoclastogenesis inhibitory factor,OPG)、Ⅰ型前胶原氨基末端肽(procollagen typeⅠNterminal propeptide,PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP)、I型胶原交联C-末端肽(TypeⅠcollagen carboxy-terminal peptide,CTX-I)含量变化;原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法分析各组肠黏膜组织细胞凋亡情况;Masson法分析各组肠黏膜组织纤维病理改变;免疫组化法检测各组肠黏膜组织中维生素D膜相关快速反应结合蛋白(membrane-associated rapid response steroid-binding,1,25-D3-MARRS)蛋白表达;蛋白免疫印迹法及RT-PCR法检测各组Jagged1、Notch1、Hes1蛋白及mRNA表达水平。结果:大鼠造模后股骨、胫骨骨密度明显下降,血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量明显变化(P<0.05);肠黏膜组织病理发生明显改变,组织纤维化增强,细胞凋亡程度增加;肠黏膜组织1,25-D3-MARRS蛋白表达降低(P<0.05)。治疗后与模型组对比,阳性组及实验组大鼠股骨、胫骨骨密度明显升高,血清中OPG、PINP、TRACP及CTX-I含量明显改善(P<0.05);肠黏膜组织病理发生明显改善,纤维化降低,细胞凋亡程度降低;肠黏膜组织中Jagged1、Notch1、Hes1蛋白及mRNA表达明显改善(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg3能够提高OP大鼠骨密度,减轻肠黏膜组织细胞凋亡及组织纤维化,增加肠黏膜1,25D3-MARRS蛋白表达,改善肠道钙吸收。