柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶的特性

目的:分析柠檬明串珠菌中D-乳酸脱氢酶(D-LDH)的酶学特性。方法:对柠檬明串珠菌KM20中D-乳酸脱氢酶基因进行克隆表达并构建表达质粒,转化至Escherichia coli BL21(DE3)中实现过表达。结果:经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,D-LDH-1与D-LDH-2编码的蛋白分子质量分别为40.0,38.5 kDa;比活力分别为2.18,153.10 U/mg;在丙酮酸还原中两种酶的最适pH值与最适温度均为8.0与40℃;而乳酸氧化时D-LDH-2的最适pH值与最适温度分别为12.0与30℃。D-LDH-1与D-LDH-2对草酰乙酸、苯丙酮酸和2-酮戊二酸具有较强的催化能力,且Ca^(2+)、Cu^(2+)和Na+对其酶活性均具有促进作用,Zn^(2+)与SDS对酶活性有极高的抑制作用。此外,两种酶对丙酮酸的Km值分别为2.98,6.11 mmol/L,对丙酮酸的K_(cat)/K_(m)分别为6.04×10^(2),2.28×10^(4)L/(mol·s),LDH-2对D-乳酸的K_(cat)/K_(m)为65.0 L/(mol·s)。结论:D-LDH-1与D-LDH-2为柠檬酸明串珠菌中催化D-乳酸合成的关键酶。

肠脂肪酸结合蛋白和D-乳酸在早期诊断嵌顿疝肠坏死中的应用研究

目的:探讨肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)和D-乳酸(D-LAC)早期诊断嵌顿疝肠坏死的价值。方法:选取36只SD大鼠,实验组(n=18)制作嵌顿疝动物模型,对照组(n=18)未制作。在术后30 min、2 h、4 h、6 h、8 h和12 h,采用ELISA检测两组血清D-LAC和I-FABP的水平;RT-qPCR鉴定嵌顿疝肠管组织中I-FABP的表达。通过嵌顿肠管大体标本、苏木素伊红(HE)染色和Chiu’s评分判定肠坏死情况。结果:与对照组相比,实验组在术后6 h时嵌顿肠管大体标本和HE染色呈典型肠绞窄表现,Chiu’s评分有统计学意义(P=0.001),血D-LAC明显升高(P=0.002);8 h时肠管逐渐向肠坏死过渡,血D-LAC进一步升高(P=0.012),血I-FABP也明显升高(P=0.001),并且肠组织中的I-FABP表达明显升高(P=0.002)。12 h时肠管呈现明显肠坏死特征、Chiu’s评分有统计学意义(P=0.001),血D-LAC和I-FABP均升至最高[(2019.60±16.17)μg/L vs(273.18±14.63)μg/L,P=0.001;(1210.94±5.96)μg/L vs(220.46±9.63)μg/L,P=0.001];肠管组织中的I-FABP表达最高[(8.20±0.60)μg/L vs(1.13±0.16)μg/L,P=0.001]。结论:嵌顿疝大鼠血清I-FABP和D-LAC水平升高,为早期诊断嵌顿疝肠管坏死的临床研究提供了依据。

高光纯D-乳酸生产菌株假肠膜明串珠菌HL64-1的分离鉴定及其发酵特性

从自然界中筛选分离产酸菌是获得高光学纯度乳酸生产菌株有效的途径之一。从腐烂果实中分离获得一株产高光学纯度D-乳酸菌株HL64-1,经形态学、16S rDNA序列分析、序列相似性Blast比对分析鉴定为假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)。在基础发酵培养基中摇瓶发酵24 h,产D-乳酸的量达到62.18 g/L,产酸速率达2.59 g/(L·h),光学纯度达99.90%(ee);在5 L发酵罐中放大培养,通过补加碳源,发酵72 h,D-乳酸产量达到78.74 g/L,平均产酸速率达1.09 g/(L·h)。该菌株可以有效利用农业副产物花生饼粉和棉籽粉作为替代氮源以降低发酵原料成本。该菌还可利用木糖产生D-乳酸,且葡萄糖能显著提高木糖的利用效率,极具工业应用前景。

厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

血清内毒素、D-乳酸与慢性肾脏病肠源性尿毒症毒素的相关性研究

目的 研究肠道屏障指标血清内毒素、D-乳酸与慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者肠源性尿毒症毒素包括硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate, IS)、尿素氮的相关性。方法 选取2019年4月~2021年8月中国中医科学院望京医院肾病内分泌科门诊及住院患者共260例CKD患者,按照CKD分期分为CKD3期组(n=51)、CKD4期组(n=130)、CKD5期组(n=79)。记录患者年龄、性别、病程、既往病史,检测患者血清IS、尿素氮、血清内毒素、D-乳酸、血肌酐,估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate, eGFR),留取患者粪便,检测大肠杆菌、双歧杆菌菌落水平。分析血清内毒素及D-乳酸与肠源性尿毒症毒素的相关性。结果 一般资料比较,3组在年龄、性别、病程、既往合并糖尿病、双歧杆菌水平方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),在既往合并高血压、冠心病、IS、血肌酐、尿素氮、eGFR、血清内毒素、D-乳酸、大肠杆菌方面比较,差异有统计学意义(P<0.05)。相关性分析:Spearman分析结果显示,血清内毒素、D-乳酸均与IS、尿素氮、血肌酐呈显著正相关(P<0.05),与eGFR呈负相关(P<0.05);Pearson分析结果显示,血清内毒素、D-乳酸均与大肠杆菌、双歧杆菌呈显著正相关(P<0.05)。多因素线性回归分析:IS是血清内毒素的独立影响因素(P<0.001),IS、尿素氮是D-乳酸的独立影响因素(P<0.05)。结论 CKD患者中血清内毒素及D-乳酸水平升高与肠源性尿毒症毒素相关。

D-乳酸对免疫低下小鼠的免疫调节作用

为探究酸奶中D-乳酸的免疫调节作用,该研究以环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠为模型,评估低(75 mg/kg bw)、中(150 mg/kg bw)、高(300 mg/kg bw)3个剂量的D-乳酸对免疫低下小鼠的免疫调节作用。结果显示,中高剂量的D-乳酸可以显著恢复免疫低下小鼠的体质量、免疫器官指数和迟发型变态反应程度。此外,不同剂量的D-乳酸可以不同程度地改善骨髓抑制的相关指标,包括改善骨髓形态结构,恢复外周血细胞数量(白细胞和淋巴细胞),上调免疫细胞核转录因子(T-bet,GATA3)表达,提高血清细胞因子白细胞介素(interleukin,IL)-2、IL-4、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M水平等。综上,D-乳酸可以增强环磷酰胺诱导的免疫低下小鼠的免疫功能。

特利加压素联合去甲肾上腺素对ICU脓毒性休克患者D-乳酸及心肌损伤指标的影响

目的:探究特利加压素联合去甲肾上腺素对重症监护室(ICU)脓毒性休克患者D-乳酸及心肌损伤指标的影响。方法:回顾性选取2019年1月—2023年12月苏州大学附属第一医院收治的116例脓毒性休克患者,按治疗方法不同分为两组,各58例。两组均予以常规治疗,对照组予以去甲肾上腺素治疗,观察组在对照组基础上联合特利加压素治疗。比较两组D-乳酸、心肌损伤指标、肾功能、不良反应。结果:两组治疗前D-乳酸、心肌损伤指标、肾功能指标对比,差异均无统计学意义(P>0.05);观察组治疗36 h后D-乳酸、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、胱抑素C(CysC)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)均较对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);两组不良反应发生率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:特利加压素联合去甲肾上腺素治疗ICU脓毒性休克患者可有效降低D-乳酸水平,改善肾功能,减轻心肌损伤,且安全可靠。

入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-乳酸水平与轮状病毒肠炎患儿病情严重程度的相关性及其联合检测对患儿发生脓毒血症的预测价值

目的探讨中性粒细胞表面白细胞分化抗原11b(CD11b)平均荧光强度、血清锌、D-乳酸(D-LAC)水平与轮状病毒肠炎(RVE)患儿病情严重程度的相关性及其联合检测对患儿发生脓毒血症的预测价值。方法回顾性选取2022年1月至2023年12月驻马店市中心医院收治的168例RVE患儿纳入研究,根据是否并发脓毒血症分为发生组33例和未发生组135例。比较两组患儿的基线资料及CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平,采用Spearman相关性分析各指标与RVE病情严重程度的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析各指标对RVE患儿发生脓毒血症的预测价值。结果脓毒血症发生组患儿的轻、中、重病情程度占比分别为3.03%、9.09%、87.88%,未发生组轻、中、重病情程度占比分别为28.15%、60.00%、11.85%,发生组病情严重程度较未发生组严重,差异有统计学意义(P<0.05);发生组患儿入院时CD11b平均荧光强度、血清D-LAC水平分别为(91.25±5.36)AU、(8.35±2.74)mg/L,明显高于未发生组的(84.30±7.28)AU、(5.80±0.67)mg/L,血清锌水平为(51.95±6.77)μmol/L,明显低于未发生组的(70.59±8.34)μmol/L,差异均有统计学意义(P<0.05);Spearman相关性分析结果显示,入院时CD11b平均荧光强度、血清D-LAC水平与RVE患儿严重程度呈正相关(r=0.685、0.709,P<0.05),血清锌水平与RVE患儿严重程度呈负相关(r=-0.664,P<0.05);ROC曲线分析结果显示,入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平联合预测RVE患儿发生脓毒血症的AUC为0.897,明显大于上述指标单独检测的0.758、0.712、0.742。结论入院时CD11b平均荧光强度、血清锌、D-LAC水平与RVE患儿病情严重程度具有一定相关性,联合检测对RVE患儿脓毒血症的发生具有较高的预测价值,可为RVE患儿病情评估及制定预防脓毒血症的方案提供参考依据。

保加利亚乳杆菌D-乳酸脱氢酶同工酶基因在大肠杆菌中的表达

通过对保加利亚乳杆菌ATCC11842的D-乳酸脱氢酶基因的克隆,分离获得了ldb0101、ldb0813、ldb1010、ldb1147和ldb2021五种同工酶基因,并分别构建重组质粒转化大肠杆菌JM109,实现D-LDH同工酶基因的表达。结合重组大肠杆菌的摇瓶发酵实验和D-乳酸的合成,初步确定D-乳酸脱氢酶Ldb0101和Ldb1010在保加利亚乳杆菌中对D-乳酸的合成起着重要的作用。

酿酒酵母产D-乳酸重组菌的构建与发酵

采用基因工程方法对酿酒酵母进行代谢改造,使酵母产生乳酸代谢途径。将来源于L.mesenteroides和E.coli的D-乳酸脱氢酶基因,分别插入带有G418抗性的酵母穿梭质粒p YX212-kan MX上,电转化酵母,得到2株生产D-乳酸的酿酒酵母重组菌S.cerevisiae WE1510和S.cerevisiae WB1186。进一步摇瓶发酵试验表明:重组菌S.cerevisiae WB1186在YEPD培养基、20 g/L糖、p H 5的条件下生长条件最好,并具有更好的产乳酸能力。经3 L发酵罐条件下验证,S.cerevisiae WB1186分批发酵96 h,最终乳酸积累量达到18.0 g/L;发酵条件为培养基YEPD,接种量10%,溶解氧(DO)30%,转速150 r/min,初始葡萄糖质量浓度10 g/L,控制pH 5.0,通气量3 L/min,OD600最大值转为厌氧发酵。

创伤后肠道通透性改变血浆标志物D-乳酸的实验研究

目的 :观察创伤时循环 D 乳酸与内毒素的变化及其意义。方法 :采用 3种大鼠模型 :(1)肠系膜上动脉夹闭 1小时肠缺血再灌注损伤模型 ;(2 ) 30 %总体表面积深 ～ 度烫伤模型 ;(3)总胰胆管人工胆汁逆行灌注的急性坏死性胰腺炎 (ANP)模型。于各时间点采集颈动脉及门静脉血 ,分别检测 D乳酸及内毒素含量。结果 :(1)肠缺血 1～ 1.5小时血浆 D乳酸和内毒素均升高 ,再灌注后显著升高 ,二者存在明显正相关(r=0 .7198,P <0 .0 5 ) ;(2 )烫伤后 6小时血浆 D乳酸和内毒素显著升高 ,两者存在明显相关 (r=0 .8771,P<0 .0 1) ;(3) ANP大鼠血浆 D 乳酸和内毒素水平在伤后 2小时开始升高 ,2 4小时达峰值 ,两者存在明显相关性 (r=0 .7985 ,P<0 .0 1)。组织病理学检查发现 3组动物均有小肠绒毛脱落 ,粘膜下炎细胞浸润等改变 ,其严重程度与血浆 D 乳酸水平一致。结论 :血浆 D 乳酸可作为创伤所致肠粘膜损伤、肠通透性改变及肠源性内毒素血症形成的预警指标。

肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因(ldhD),将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果 100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10 mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04 U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50 mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16 U/mg和0.07 U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数KM为10.54 mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09 g/L。

高效液相色谱法对泡菜中L-乳酸和D-乳酸的手性分离和测定

采用高效液相法和手性分离柱对泡菜发酵上清液中的L-乳酸和D-乳酸进行分离和测定。泡菜的培养上清液用8000r/min离心20min,再用0.45μm滤膜过滤。滤液用配备二极管阵列检测器的高效液相系统检测,检测波长为254nm。检测色谱柱为手性柱Chirex3126(D)-penicillami(4.6mmi.d×250mmL,5μm),流动相为2mmol/LCuSO4溶液(溶剂为5%的异丙醇溶液)。L-乳酸和D-乳酸的标准曲线在2.5-20.0g/L范围线性良好,两者的线性相关系数都为0.999。泡菜滤液的L-乳酸和D-乳酸的回收率分别是99.82%和100.02%。该方法操作简便,精密度和准确度高,适用于泡菜中L-乳酸和D-乳酸的测定。

D-乳酸脱氢酶基因克隆及其表达

构建了一株产D ,L 乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD 1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ1 4 4作为宿主 ,在厌氧条件下通过互补筛选获得乳酸脱氢酶基因 (ldh) ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Native PAGE)检测证明其阳性克隆表现出D 乳酸脱氢酶 (D LDH)活性。核酸序列分析表明 ,ldhD的ORF编码 331个氨基酸残基组成的蛋白质有两个保守区域 ,其中V1 47～D1 76 区是NADH的结合位点 ,R77～E1 0 7区据报道是酶的活性部位。该菌株D LDH和D羟基异己酸脱氢酶 (D HicDH)属于NADH依赖性脱氢酶家族 ,ldhD和其他乳杆菌属的ldhD及D HicDH基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核酸序列相似性最高达 4 9 33% ,氨基酸序列相同性最高为 4 2 % ,是一个新的D

D-乳酸制备研究进展

高光学纯度D-乳酸在聚乳酸高性能材料方面的应用带动了D-乳酸生产工艺研究的发展。本文综述了D-乳酸的应用、光学纯度的分析方法以及制备工艺,着重介绍了D-乳酸的生产菌种选育和D-乳酸发酵的国内外研究进展,D-乳酸基因工程菌改造也已形成一定的竞争力,并指出开发光学纯度高、产量高、转化率高,发酵周期短和底物利用范围广的D-乳酸高产菌还可进一步提升D-乳酸的制备技术。

肝炎肝硬化患者血浆D-乳酸、二胺氧化酶和内毒素的检测及其临床意义

目的 探讨血D 乳酸、二胺氧化酶 (DAO)和内毒素水平在肝炎肝硬化患者中的变化及其临床意义。方法 将 5 0例肝炎肝硬化患者和 3 0例健康体检者分为试验组和对照组 ,采用分光光度法检测外周血中D 乳酸、DAO和内毒素的活性。结果 肝炎肝硬化患者试验组D 乳酸活性明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,试验组 3组间比较差异有显著性 (P <0 .0 1) ,治疗后显著低于治疗前 (P <0 .0 1) ;试验组DAO活性明显高于对照组 ,组间比较Child PughC级组活性明显低于Child PughB级组 (P <0 .0 1) ,治疗后A级组及B级组水平显著低于治疗前 (P <0 .0 5 ) ,C级组水平显著高于治疗前 (P <0 .0 5 ) ;Child PughA级组内毒素活性与对照组比较差异显著性 (P >0 .0 5 ) ,Child PughB、C级组明显高于对照组 (P <0 .0 1) ,治疗后A、B级组水平与治疗前比较差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,C级组水平显著降低 (P <0 .0 1)。相关分析显示 3者水平均相关。结论 血浆D 乳酸、DAO水平是肠粘膜损伤早期诊断的敏感指标 。

发酵法生产D-乳酸的研究进展

从发酵菌种、发酵工艺等方面综述了发酵法生产D-乳酸的国内外研究现状,着重介绍了代谢工程在发酵产酸方面的应用,对今后的研究趋势进行了展望。

不同肠道病毒感染手足口病患儿儿茶酚胺、S-100蛋白及D-乳酸水平变化及其临床意义

目的探讨不同肠道病毒感染手足口病(HFMD)患儿儿茶酚胺(CA)、S-100蛋白和D-乳酸水平的变化及其临床意义。方法选取2014年4—7月在昆明市儿童医院感染科住院并确诊为HFMD的患儿129例。使用GC-2016γ放射免疫计数仪采用放射免疫法进行CA测定[主要包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(AD)、多巴胺(DA)];使用美国宝莱特ELx800NB酶标仪采用酶联免疫法进行S-100蛋白测定;使用美国宝莱特ELx800NB酶标仪采用酶联免疫法进行D-乳酸测定;使用德国ABI公司生产的7500PCR扩增仪采用实时荧光定量PCR方法进行粪便病原体的检测及分型。结果 129例HFMD患儿中,肠道病毒71型(EV71)阳性57例(44.2%),柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)阳性26例(20.2%),其他肠道病毒阳性20例(15.5%),肠道病毒阴性26例(20.1%)。不同肠道病毒感染HFMD患儿NE、AD、DA、S-100蛋白水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同肠道病毒感染HFMD患儿D-乳酸水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中EV71阳性HFMD患儿D-乳酸水平高于其他肠道病毒阳性、肠道病毒阴性患儿。结论不同肠道病毒感染HFMD患儿CA、S-100蛋白水平间无差异,而EV71感染HFMD患儿D-乳酸水平较高,存在肠屏障通透性增加。

茴香枳术汤对粘连性肠梗阻大鼠血浆D-乳酸的影响

目的观察茴香枳术汤对粘连性肠梗阻大鼠血浆D-乳酸的影响,了解其在粘连性肠梗阻的作用机制。方法制备大鼠粘连性肠梗阻模型,随机分为正常组、模型组、大承气汤组及茴香枳术汤低(1.13 g/mL)、中(2.25 g/mL)、高(3.38 g/mL)剂量组。给予药物治疗后第3、5、7天,共3个时间点,每时间点6只;股动脉取血,Brandt法测定血浆D-乳酸含量。结果与正常组比较,模型组血浆D-乳酸含量显著增加(P<0.05);与模型组比较,大承气汤组及茴香枳术汤低剂量组、中剂量组和高剂量组血浆D-乳酸含量显著下降(P<0.01)。结论茴香枳术汤有很好的治疗粘连性肠梗阻的作用。其主要作用与恢复肠屏障功能有关。