肺炎克雷伯氏菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因(ldhD),将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果 100%正确。将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21(DE3)-pET-22b(+)-ldhD基因工程菌。重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10 mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04 U/mL的酶活力;底物D-乳酸终浓度为50 mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力。比酶活则分别为9.16 U/mg和0.07 U/mg。通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数KM为10.54 mmol/L。经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09 g/L。

德式乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从德式乳杆菌的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19Ku特异蛋白条带。

假肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides 1159)的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19 ku的特异蛋白条带。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。