青花菜多聚半乳糖醛酸酶基因BoPGX3的克隆及盐胁迫下的表达特征分析

多聚半乳糖醛酸酶(PG)可降解细胞壁,从而降低植物抵抗能力。为了解青花菜PG基因响应盐胁迫的分子机制,以青花菜自交系‘WN12-95B’为试验材料,提取青花菜的总RNA并合成cDNA,克隆PG基因,并检测其在盐胁迫下的表达特征。结果表明:青花菜BoPGX3基因序列全长1476 bp,推导编码491个氨基酸,相对分子量为53.44 kD,等电点为5.84。系统进化分析表明,青花菜BoPGX3与羽衣甘蓝、甘蓝、白菜、萝卜和花椰菜的PG基因亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,BoPGX3基因受盐胁迫诱导表达,处理3 h后相对表达量达到初始表达量的2.9倍,处理12 h时相对表达量下降至初始表达量的1.4倍。综上,青花菜BoPGX3基因参与了盐胁迫的响应,并可能在此过程中发挥着重要的作用。

Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖的制备方法和结构表征的研究进展

Ⅱ型鼠李半乳糖醛酸聚糖(RG-Ⅱ)是果胶结构域中的一种,其结构在不同物种之间具有高度的保守性。RG-Ⅱ的主链由约9个半乳糖醛酸经α-1,4糖苷键连接而成,并被6个(A–F)明确定义的侧链取代。其中二糖侧链C、D和单糖侧链E、F的结构在不同来源的RG-Ⅱ中基本保持相同。寡糖侧链A和B则存在轻微的变异性。通过相对分子质量、单糖组成和质谱分析等手段可实现RG-Ⅱ的结构表征。中药中含有RG-Ⅱ结构域的多糖具有很高的药用价值,使用内切多聚半乳糖醛酸酶(Endo-PG)和草酸青霉可将RG-Ⅱ从中药中分离并对其在多糖中的含量进行测定。从葡萄酒中可快速制备大量RG-Ⅱ标准品用于新定量方法的开发,实现对中药活性多糖的质量控制,推动中药多糖的研究进程。

莲腐败病菌多聚半乳糖醛酸酶Fcpg1基因功能研究

【目的】共享镰刀菌(Fusarium commune)侵染莲引起的莲腐败病严重影响莲的生产,鉴定莲腐败病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因Fcpg1,分析其在生长发育及致病过程中的作用,为进一步研究共享镰刀菌的致病机理及莲腐败病菌的防治提供依据。【方法】利用BLASTP在莲腐败病菌全基因组数据中查找PG同源蛋白,并使用ExPASy等在线软件对Fcpg1氨基酸序列进行生物信息学分析。通过基因敲除的方法,获得Fcpg1基因敲除突变体ΔFcpg1和回补菌株ΔFcpg1-Com。测定野生型菌株FCN23、突变体ΔFcpg1和回补菌株ΔFcpg1-Com的菌落形态、生长速率、产孢量及致病力。【结果】Fcpg1基因编码388个氨基酸,分子量为40.354 ku,分子式为C_(1756)H_(2775)N_(489)O_(577)S_(12),理论等电点为6.57,脂溶系数为79.9。Fcpg1为稳定的、易溶于水的外泌性蛋白,其信号肽剪切位点在第16~17个氨基酸,主要定位于胞外基质。Fcpg1蛋白与尖孢镰刀菌的多聚半乳糖醛酸酶蛋白序列具有较高的同源性。与野生型菌株FCN23和回补菌株ΔFcpg1-Com相比,ΔFcpg1突变体的菌落形态、营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但突变体ΔFcpg1的致病力显著减弱。【结论】Fcpg1是典型的多聚半乳糖醛酸酶蛋白,参与对莲腐败病致病力的调控。

基于聚半乳糖醛酸的聚合物胶束制备及性能

以胱胺(CYS)和脱氧胆酸(DOCA)为原料合成了胱胺修饰的脱氧胆酸(CD),再将CD的氨基(―NH_(2))与聚半乳糖醛酸(PGA)的羧基(―COOH)通过酰胺化反应制得PGA-g-CD聚合物,并自组装为胶束。通过调节n(―NH_(2))∶n(―COOH)对胶束载药性能进行调控。测试了聚合物的结构及聚合物胶束的载药和释药性能。结果表明,最佳投料比为n(―NH_(2))∶n(―COOH)=1.3∶1,在该条件下,CD在聚合物中取代度为31%,临界胶束浓度为0.025 mg/mL,胶束载药量达11.53%,载药胶束粒径和粒径多分散系数分别为(296.1±0.3)nm和0.101±0.053,在还原性环境中36 h的释药量可达78.8%,体现良好的还原响应性。

巨峰葡萄半乳糖醛酸转移酶基因GAUT克隆及在摘心处理下的表达分析

半乳糖醛酸转移酶(GAUT)是果胶合成过程的关键酶,对植物茎和叶的细胞壁等组织器官生长发育具有重要调控作用。为探究摘心处理下GAUT在葡萄茎和叶中的表达,以巨峰葡萄(Vitis labrusca×Vitis vinifera Kyoho)为材料,进行VvGAUTs克隆,利用生物信息学方法预测分析基因结构与功能,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在巨峰葡萄摘心处理下的表达模式。结果表明,本研究克隆得到4个巨峰葡萄GAUTs,开放阅读框(ORF)长度分别为1056、1167、1038和1071 bp,分别编码351、388、345和356个氨基酸,与葡萄基因组相应基因序列同源性均达到98%以上,分别命名为VvGAUT1a、VvGAUT1b、VvGAUT3、VvGAUT4a。VvGAUT1a编码稳定蛋白,其余3个基因编码不稳定蛋白;VvGAUTs与纤维素、木质素和糖代谢等相关蛋白密切互作。VvGAUTs在不同摘心处理的巨峰葡萄茎、叶中表达模式差异显著,2叶摘心处理总体上抑制茎VvGAUTs基因表达,而VvGAUTs在叶中的表达呈现生长前期增强、生长后期受抑制的趋势。此外,在巨峰葡萄生长前期VvGAUT1a、VvGAUT1b和VvGAUT3在茎、叶的表达明显高于生长后期,而VvGAUT4a在巨峰葡萄茎生长后期表达增强,在叶中表达变化较平缓。综上,摘心调控巨峰葡萄VvGAUTs基因表达,可能在控制其茎、叶生长,平衡营养生长和生殖生长过程中发挥重要作用。本研究结果为探究摘心调控葡萄树体生长的分子机制提供了理论依据。

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种内切多聚半乳糖醛酸酶基因的比较

通过基因克隆和测序方法,对来自国内外尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp.cubense(简称Foc) 1号和4号小种的6个菌株endo-PG基因同源性、与其他真菌的亲缘关系以及endo-PG基因和氨基酸序列进行分析,为香蕉枯萎病菌致病机制的研究奠定基础。结果表明,同小种的endo-PG序列同源性高,亲缘关系近,不同小种的同源性较低,亲缘关系较远;总体来说,4号小种比1号小种同源性更高,亲缘关系更近。在全基因序列分析中,没有发现明显的基因差异可以作为区分2个小种致病性差异的依据。根据预测的CDS序列翻译成氨基酸序列比对,发现6个菌株的endo-PG基因编码的氨基酸变异并没有引起相关保守结构域的变化,推测6个菌株的致病性可能与endo-PG基因的调控相关。

3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定D-半乳糖醛酸含量的条件探索

[目的]优化3,5-二硝基水杨酸（DNS）法用于测定D-半乳糖醛酸含量的条件。[方法]通过单因素实验研究了3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定D-半乳糖醛酸含量的测定条件。[结果]单因素试实结果表明,利用3,5-二硝基水杨酸法测定D-半乳糖醛酸含量的优化条件为：测定波长540 nm,DNS用量4.0 ml,反应温度100℃,反应时间5 min,最佳测定时间60 min内。此条件下回归方程y=1.0226x-0.2784,回归系数r=0.9997,平均回收率99.96%,D-半乳糖醛酸含量测定范围0.5-1.1 mg/ml,统计分析表明,该方程显著存在。[结论]多次实验验证,该方法测定D-半乳糖醛酸含量时操作简单、准确度高、重复性好。

酶解果胶制备寡聚半乳糖醛酸及其对浆果类果实成熟软化的影响

以易腐烂、难贮藏的浆果类果实为试验对象,选取果胶酶酶解不同来源果胶制备寡聚半乳糖醛酸(oligogalacturonides,OGs),结合高效液相色谱以及RNA定量逆转录-聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术研究寡糖与果实软化关联机制并进行应用测试。结果表明,以果胶酶酶解来源于柑橘皮与苹果渣的果胶得到的OGs缓解果实软化效果较好,处理组果实硬度分别是对照组的1.68倍和1.40倍。同时,果胶的酯化度不同,减缓果实软化的效果也有所差异。结合高效液相色谱以及采后生理学分析,发现保留时间在14 min以内的OGs具有良好的调控果实软化的能力。通过qRT-PCR发现OGs诱导可明显下调细胞壁降解相关基因(SlPG2、SlPL3、SlPL5)。将OGs在红提葡萄、蓝莓、草莓3种浆果类果实中进行应用,发现OGs减缓果实软化的能力同样明显,处理组果实硬度分别比对照组高38.22%、37.48%、69.87%,且有效降低果实贮藏期间腐烂率,表明OGs可有效抑制以上3种浆果采后软化、腐烂等品质劣变问题。

毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP的生物信息学分析

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP)可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶,从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解,以增强植物病原菌抗性。为探明模式树种杨树PGIP抗病机制,对毛果杨PGIP(PtPGIP)家族成员进行鉴定,以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。结果表明,毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP基因,其中,PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复,PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复;PtPGIP1是假基因,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP蛋白结构域。PtPGIP均为疏水蛋白,具有良好的脂溶性,且具有3~7个N-糖基化位点。亚细胞定位预测表明,其可能定位于细胞外。除PtPGIP1以外,PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR片段,LRR中的保守序列xxLxLxx及蛋白质分子对接均表现出差异性。PtPGIP基因的表达具有组织特异性,PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低,PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表达量高于叶片,尤其是PtPGIP2基因在花序中的表达量最高,说明毛果杨PGIP基因家族发生了功能分化,使其在应对多种逆境胁迫中发挥重要作用。

拟康宁木霉聚半乳糖醛酸酶的酶学特征及潜在应用

从桂北果园土壤中筛选到1株产聚半乳糖醛酸酶(酶活力为29.2 U/mL)的丝状真菌,鉴定该菌为拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)。以聚半乳糖醛酸为底物,测得该酶最适反应温度为50℃,且在50℃条件下保温1 h,仍能保持70%以上最大酶活力,属于中高温酶。该酶具有独特的弱酸性催化特征,最适反应pH 5.0,且在pH 6.0仍具有73%最大酶活力,并在pH 2.5~8.0条件下具有一定耐受性。Zn^(2+)对酶活性具有部分激活作用,Mn^(2+)则对该酶有一定抑制作用。针对5种弱酸性水果果浆(木瓜、香蕉、芭蕉及火龙果(红心和白心))脱胶实验结果显示,该酶对5种水果的脱胶效果都有不同程度提高,其中芭蕉果浆出汁率提高了24.4%,木瓜果浆黏度下降了82.5%,红心火龙果果浆透光率提高了31.9%,3种水果脱胶效果显著。本研究挖掘出一种新型产聚半乳糖醛酸酶菌株,对于热带、亚热带易腐烂水果的果汁生产具有较好的应用前景。

氨基胍、葛根素、小檗碱、黄芩苷和甘草酸对D-半乳糖诱导大鼠醛糖还原酶活性和蛋白非酶糖化作用的比较

目的观察氨基胍、葛根素、小檗碱、黄芩苷和甘草酸对D-半乳糖(D-gal)诱导大鼠体内醛糖还原酶(AR)活性、糖耐量和蛋白非酶糖基化反应的作用。方法除空白对照组外,其余大鼠均采用腹腔注射(ip)D-gal 150mg? kg-1,qd×56d致病,D-gal处理大鼠2周后,将大鼠按体重均衡随机分成:模型对照、氨基胍、葛根素、小檗碱、黄芩苷和甘草酸5组,然后继续ip D-gal处理同时灌胃给予不同药物(300mg?kg-1?10ml-1)或蒸馏水,qd×42d;实验结束时,观察5药对D-半乳糖诱导大鼠体内醛糖还原酶(AR)活性、糖耐量和蛋白非酶糖基化反应的作用。结果与空白对照组比较,D-gal处理大鼠出现糖耐量减退(IGT)、糖基化产物(包括糖化血红蛋白即HbA1c、果糖胺和晚期糖基化终产物)增高以及红细胞内AR活性增强(P<0．01);氨基胍、葛根素、小檗碱、黄芩苷与甘草酸均能明显抑制AR活性(P<0．01-0．05);氨基胍、葛根素、小檗碱和黄芩苷均能改善D-gal诱导大鼠IGT(P<0．01-<0．05);氨基胍、葛根素和小檗碱能降低糖基化产物的含量(P<0．01-0．05),而黄芩苷仅降低HbA1c含量(P<0．05);甘草酸对糖基化产物含量未见明显影响(P>0．05)。结论氨基胍、葛根素、小檗碱、黄芩苷和甘草酸均能抑制D- gal诱导大鼠体内醛糖还原酶活性,氨基胍、葛根素与小檗碱对D-gal诱致的大鼠糖基化反应具有明显的抑制作用,而黄芩苷对大鼠糖基化反应具有部分抑制作用,甘草酸对大鼠糖基化反应未见抑制作用。

番茄果实中乙烯与多聚半乳糖醛酸酶的关系

乙烯与多聚半乳糖醛酸酶(PG)都是果实成熟过程中关键的调节因子。一方面,在有乙烯合成缺陷的转反义ACS番茄和乙烯感受缺陷的Nr突变体番茄果实中PG基因表达量都明显下降,PG酶活性明显降低;用外源乙烯(100μL／L)处理绿熟期番茄果实使PG基因的表达明显增强,而1-甲基环丙烯(1-MCP,1 μL／L)处理转色期番茄果实明显抑制PG基因表达。另一方面,转反义PG基因番茄果实乙烯释放量在授粉后低于其野生型,番茄乙烯受体基因LeETR4和乙烯反应因子LeERF2基因表达量比野生种低。PG降解果胶的产物D-GA(100 mg／L)促进未熟期番茄果实中的乙烯生成和LeETR4、LeERF2基因的表达。

β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶对桃果实成熟软化的影响

以雨花3号桃果实为试验材料,采用气相色谱法测定不同成熟时期桃果实的乙烯释放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的变化,并分析β-半乳糖苷酶(-βG al)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的变化,探讨-βG al和PG对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,具有明显的乙烯跃变高峰,ACC合成酶和ACC氧化酶活性变化趋势与乙烯变化相一致;PG活性高峰与乙烯释放高峰同时出现于成熟度Ⅳ,而-βG al活性高峰出现于成熟前期(即成熟度Ⅰ);-βG al不同于PG,其作用主要与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关。

番茄多聚半乳糖醛酸酶cDNA的克隆及其对番茄中PG表达的反义抑制

通过PCR扩增获得了包含多聚半乳糖醛酸酶(PG)全部阅读框架的1.5kb cDNA,经限制酶酶谱和部分序列分析鉴定无误后,将其以反方向插入含两个增强子的35S启动子和Nos3＇端之间,构建成表达PG反义RNA的双元载体,经农杆菌途径转化番茄品种“丽春”,获得了60株抗卡那霉素再生植株,经PCR检测,证明有2/3的再生植株有外源PG基因导入,成熟果实的PG粗提液的SDS-PAGE分析表明:若干株系中PG蛋白量较对照有不同程度的下降。PG活性亦同步下降,其中一个株系3~#,PG酶活下降了93％。这些结果表明外源PG基因的反方向导入有效地抑制了内源PG基因的表达。

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌(Valsa mali)两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过q RT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】q RT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。

苯酚-硫酸法结合校正因子法测定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量

目的:建立一种基于苯酚-硫酸法结合校正因子法测定含半乳糖醛酸(GalA)的多糖中糖含量的方法。方法:优化苯酚-硫酸法的测定条件,以不同质量比的GalA-葡萄糖(Glc)混合对照品溶液绘制系列标准曲线并测定含GalA的党参多糖CPP1b样品中的糖含量,在此基础上,根据GalA-Glc质量比为0-100%时的回归方程,以党参多糖CPP1b为参照多糖计算校正因子,对样品中的糖含量测定结果进行校正,并以与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品对此方法合理性进行验证。结果:经计算,党参多糖CPP1b对Glc的校正因子为3.33,验证试验中与党参多糖CPP1b组成相同的混合单糖对照品的糖含量测定结果为103.47%。精密度、稳定性试验的RSD<1%;加样回收率为93.52%~107.35%(RSD=5.09%,n=6)。结论:该研究建立的方法可准确测定类似于党参多糖CPP1b的含GalA的多糖中的糖含量。

多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因转化加工番茄

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导将多聚半乳糖醛酸酶(PG)反义基因导入新疆加工番茄(代号:99-162混)。卡那霉素抗性筛选,获得移栽成活的10株再生植株,PCR和Southern blot检测表明,其中4株再生植株的染色体中有外源基因的插入。所得4株转基因加工番茄在基因转化处理当代表现不同;果实饱满有光泽;Northern杂交结果表明,转反义PG基因加工番茄果实外果皮PG基因表达水平比对照低。转基因植株的表型观察和分子检测结果相吻合。

植物多聚半乳糖醛酸酶的结构与功能—文献综述

概述了植物多聚半乳糖醛酸酶(PG) 的作用方式、组织定位、序列结构及其功能等。对PG 同工酶、序列差异性及功能多样性进行了讨论。

纤维素酶和多聚半乳糖醛酸酶与果实成熟

对果实成熟软化过程中组织超微结构变化以及Cx和PG对果实成熟软化的作用,Cx、PG在分子水平上的研究和尚待进一步研究的问题进行了系统综述:果实成熟软化与Cx、PG活性增强直接相关,PG在果实成熟软化过程中对果实着色也有着一定影响;编码Cx的基因已经在某些果实的cDNA文库中被鉴定;利用反义RNA技术对PG进行负调控是研究PG对果实成熟软化作用的主要手段。目前对Cx、PG在果实成熟过程中的作用研究主要集中在呼吸跃变型果实上,而在非呼吸跃变果实中的作用很可能有所不同。因此,研究Cx、PG在柑橘等非呼吸跃变果实成熟过程中的作用将是尚待研究的又一重要方向。

聚半乳糖醛酸酶高产菌的筛选及产酶条件研究

从腐烂的苹果中定向分离筛选出适合液态发酵法生产聚半乳糖醛酸酶的菌株YL-9,鉴定为扩展青霉(Penicillium expansum-Link)。经摇瓶产酶试验可知,此菌株的产酶培养基组成为:果胶0.7%,NaNO30.1%,MgSO40.02%,FeSO40.001%,KH2PO40.03%,豆粉1.0%,马铃薯20.0%;发酵条件为培养温度28℃,初始pH7.0,装液量50mL/250mL,接种量7%(v/v),培养时间48h。该条件下,酶活力达8.52U/mL。