Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。

D-塔格糖3-差向异构酶家族蛋白的研究进展

稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进展进行了综述;同时,展望了DTE家族蛋白的研究趋势。

Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析,杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明,Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族,并具有较高的生物转化率,反应10h后转化率达到20%。

Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。

D-塔格糖3-差向异构酶的固定化研究

从14种离子交换树脂和吸附树脂中,筛选出固定化效果较好的大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂D301-Ⅲ为载体,以戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法对D-塔格糖3-差向异构酶的固定化进行研究。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量为2.00mL/g(粗酶液/树脂),吸附pH7.5,吸附时间为8h,吸附温度为30℃,戊二醛浓度为0.05%,交联时间为3h,固定化酶活回收率可达50%以上。固定化酶重复使用10次,酶活仍能稳定保持在初始酶活的65%以上,具有良好的操作稳定性。

D-塔格糖3-差向异构酶的储存稳定性

为提高D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimeriase,DTE)粗酶液的储存稳定性,在其粗酶液中添加防腐剂以及糖类、盐类、多元醇类与蛋白质等稳定剂。通过单因子研究与正交实验,研究了它们对酶液储存稳定性的影响。结果表明:0.3%尼泊金甲酯(methylparaben,Met)有较佳的防腐效果,且能显著降低酶液的失活速率;果糖、肌醇、Mg SO4是DTE良好的稳定剂,其组合2 mmol/L Mg SO4,6%果糖,4%肌醇为最优的复合稳定剂;将加有0.3%Met和复合稳定剂的粗酶液在25℃下保存,粗酶失活半衰期为62 d,而仅加防腐剂Met的半衰期为25 d,空白酶液仅2 d。因此,复合稳定剂与防腐剂Me的联合使用能较好地提高DTE粗酶液的储存稳定性。

祖先序列重建增强D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性

为解决现有D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)热稳定性差的产业问题,本文采用系统发育指导的大数据挖掘、合理修饰和祖先序列重建策略(ASR),重建了具有不同催化结构域DAEase的祖先序列,构建了表达载体,通过重组表达与分子对接筛选出了DAEase A13并进行酶学性质表征,此外,还基于结构分析与分子动力学模拟揭示了DAEase A13热稳定性增强的分子机制。结果表明,基于ASR策略所构建的A13 70℃时半衰期可达8.4 h,其热稳定性较野生(WT)酶显著增强,最大转化率为31%,催化活性也略高于WT酶。立体结构模拟与分子动力学模拟揭示了ASR A13中大量氢键和疏水作用的增加维持了高温下酶分子结构的稳定性,是其热稳定性增强的主要因素。研究结果证实了ASR策略可以改造DAEase使其稳定性、活性和混杂性增强,可以为D-阿洛酮糖工业生产提供良好的生物催化剂。

乳糖诱导D塔格糖3差向异构酶基因在大肠杆菌中的表达

以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性。在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研究诱导条件对目的蛋白表达的影响。结果表明,工程菌培养至对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,于20℃的条件下诱导7h,可获得最大酶活。与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)最适诱导条件相比,优化后的乳糖诱导酶活提高82.7%,可溶性目的蛋白的表达量提高99.5%,菌体生物量提高30.5%。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于D-塔格糖3-差向异构酶的工业化生产提供有益的参考和借鉴。

重组大肠杆菌发酵条件优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的研究

功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得了最佳的培养基组合:蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO_(4)3 g/L、KH2PO_(4)3 g/L、MgSO_(4)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 mmol/L。在此基础上,利用单因素试验对培养条件进行研究,确定了最佳发酵诱导时间(10 h)、接种量(3%,摇瓶)、装液量(30%)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加浓度(1 mmol/L),使OD_(600)增加了1.46倍,酶活提高了2.57倍。在此基础上,利用5 L发酵罐进行放大发酵实验,确定了最佳诱导时间。在最佳条件下,经过18 h的诱导发酵,菌体OD_(600)最高值达51.8,干重达到21.5 g/L,酶活达到103.8 U/mL。当细胞添加量为0.014 g DCW/L时,以500 g/L D-果糖为底物,pH为7,50℃,1 h转化率达28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可达149.74 g/L。该研究对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵生产具有参考价值。

高稳定液态D-阿洛酮糖3-差向异构酶制剂研究

为解决D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAE)衰减过快、贮运成本高的问题,拟开发一款具有良好存贮稳定性的DEA液态酶制剂。以半衰期为评价依据,通过单因素试验筛选出对半衰期影响显著的4个因素,并进一步利用响应曲面法对酶制剂的配方进行优化。结果表明:稳定DAE酶制剂的最佳配比为0.1mol·L^(-1)CaCl_(2)、3.96%海藻糖、41.68%葡萄糖、29.32%PEG-400。在此条件下,半衰期为292天,与模拟理论值的相对误差仅为0.17%。通过工艺优化,将DAE的储存时间大幅延长,提高了酶制剂的贮运性能。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。

壳聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-果糖。实验结果表明:固定时间为3h,酶∶载体=15∶1(U/g),其酶活回收率达到45%。相比游离酶,固定化酶具有更高的温度稳定性以及在较宽的pH范围内保持较高酶活,其最适温度和pH分别为60℃与8.5。固定化酶在填充床中反应的最高转化率为24%,在最佳流速2.5mL/min下其转化率为19%,相关产率为6.7g/L·h,经过168h的反应,其转化率仍然保持在13%以上。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co^(2+)、Mn^(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。

工程大肠杆菌异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导工艺研究

以异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPEase)的工程大肠杆菌为出发菌株,在5L发酵罐培养的基础上,系统研究了大肠杆菌异源表达DPEase酶的诱导工艺。通过依次考察诱导时间点、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对工程大肠杆菌生长和DPEase酶活(单位时间内的转化率)的影响,综合考虑能耗和发酵周期,确定相应的最佳控制点,系统优化诱导条件。结果表明:指数生长期进行诱导,诱导前培养温度由37℃降至25℃、pH恒定7.0、IPTG诱导剂添加终浓度为0.5 mmol/L,可以理想平衡菌体生长和蛋白酶表达,反应30 min的DPEase酶平衡转化率达到28%左右,达到已公开报道的平均水平,为后续的生物转化工艺摸索提供原料供应。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55℃,Co^(2+)能够显著(P<0.05)增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/L IPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到(10.11±0.02)U/g,比优化前(1.38±0.01)U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为(11.47±0.04)g/L,比优化前(1.03±0.02)g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著(P<0.05)提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。

通过稳定剂提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的贮存稳定性

利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)对D-果糖的异构化反应是目前制备D-阿洛酮糖最经济环保的方式。但因DPE贮存稳定性较差,限制了其工业化应用。该文以Clostridium cellulolyticum DPE(CcDPE)为研究对象,寻找绿色高效、成本低廉且不影响后续酶反应的贮存稳定剂。考察了糖类、金属离子与多元醇类等稳定剂对CcDPE贮存效果和对后续酶反应的影响。先进行单因素实验,后对获得的2个最适的稳定剂进行复配。结果表明,甘油和Co^(2+)能显著提高CcDPE粗酶液的贮存稳定性,且不会对后续酶转化反应造成负面影响。在25℃下,1 mmol/L Co^(2+)可以将粗酶液半衰期从4.5 d延长到46 d;30%(体积分数)甘油可以将半衰期延长到33 d;20%(体积分数)甘油与0.5 mmol/L Co^(2+)的复配组合可以将半衰期延长至80 d。研究结果为CcDPE的进一步工业化应用提供了技术支撑。

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。

各种化学条件对Merdimonas faecis BR31T D-阿洛酮糖3-差向异构酶的影响

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能够催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的酶,在不同化学条件下D-阿洛酮糖会表现出不同的活性:温度过高过低都会影响其活性,经研究得到在60℃该酶表现出最优活性;过酸过碱的条件也不利于酶活性的表达,只有在中性环境下能表现出最优活性;而不同二价金属离子存在时,也会不同程度的抑制或者增加酶的活性,当加入Co2+时得到最优活性。