D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

酵母细胞催化不对称合成D-扁桃酸甲酯的反应条件优化

采用酿酒酵母催化苯乙酮酸甲酯不对称合成D 扁桃酸甲酯 ,其过程的最佳转化pH值为 7 0左右 .酵母生长代谢环境中的温度和氧水平对底物转化均有较大影响 .采用固定化细胞填充床反应器转化苯乙酮酸甲酯 ,每克酵母湿菌体进料负荷为 0 2mmol d ,成功运行 2 5d ,转化率保持在 80 %以上 ,D 扁桃酸甲酯ee值达 95 %以上 .

(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐的合成

邻二氟苯经傅-克酰化、用硼烷在CBS催化下不对称还原、与膦酰基乙酸三乙酯反应得(1R,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基甲酸乙酯,氨解后进行霍夫曼降解,最后与D-扁桃酸成盐制得替卡格雷关键中间体(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐,总收率32%。同法制得其对映异构体(1S,2R)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺L-扁桃酸盐及外消旋体2-(3,4-二氟苯基)环丙胺草酸盐。并建立了(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺D-扁桃酸盐的手性HPLC检测方法,ee值99.9%。

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO_4 0.5 g/L,ZnSO_4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h。

酿酒酵母中的D-(-)-扁桃酸脱氢酶

酿酒酵母BY1.1b对苯乙酮酸不对称还原成D-(-)-扁桃酸的反应具有高度的催化还原活性和光学选择性。采用超声波细胞破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析及Sephacryl S-200分子筛层析等步骤,从酵母BY1.1b中分离纯化得到D-(-)-扁桃酸脱氢酶。该酶的相对分子质量约60000。该酶的生物合成模式为非细胞生长偶联型和非底物诱导型。该酶与酵母醇脱氢酶、马肝醇脱氢酶、乳酸脱氢酶及丙酮酸脱氢酶的底物特异性具有显著差别,是一种新型的脱氢酶。

D-(-)-O-甲酰基扁桃酸酰氯的制备工艺改进

以D-扁桃酸为原料、以无水甲酸为甲酰化试剂、以氯化亚砜为氯化剂,采用“一步法”进行化学反应,合成D-(-)-O-甲酰基扁桃酸酰氯,得到收率大于91%、纯度大于99%以上的D-(-)-O-甲酰基扁桃酸酰氯;实验摒除了甲酸钠的干燥工序,降低了设备投资;采用氯化亚砜作为氯化剂,副产物均为气体,易于排出反应体系,产品纯度高;尾气回收,实现绿色环保生产。

(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺扁桃酸盐的合成

以邻二氟苯为原料,经傅克酰化、缩合、还原、环合,最后与D-扁桃酸成盐制得替卡格雷关键中间体(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺扁桃酸盐,总收率32.6%,ee值99.8%。

光度法快速分析苯乙酮酸含量的研究

研究了一种快速定量分析发酵液中苯乙酮酸的方法。在氢氧化钠溶液中,苯乙酮酸和2,4-二硝基苯肼形成一种红棕色的溶液,该溶液在458 nm处有最大吸收,据此可以快速分析混合物中苯乙酮酸的含量。该法在微生物还原苯乙酮酸生产D-扁桃酸的工艺中进行样品分析,结果表明方法简便、快速、灵敏度高,可以用于监控反应进程。

D-(-)-扁桃酸拆分DL-半胱氨酸盐酸盐的研究

改进了D-(-)-扁桃酸拆分DL-半胱氨酸盐酸盐制备D-半胱氨酸盐酸盐的方法。DL-半胱氨酸盐酸盐与D-(-)-扁桃酸在水中成盐后,得到的非对映体盐,纯化后经盐酸分解、10%的乙醇-丙酮溶液重结晶后得到目标产物,拆分收率25·6%。

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-（-）-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-（-）-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km（NADH）=99.2μmol/L和Km（苯乙酮酸）=263.3μmol/L.

壳聚糖球固定化酵母细胞的研究

以戊二醛为交联剂,将壳聚糖球交联引入醛基,然后将交联的壳聚糖球浸泡在酵母细胞悬浮液中,制备了固定化酵母细胞壳聚糖球。以苯乙酮酸为底物,催化合成了D-扁桃酸。最优固定化条件是戊二醛的质量分数w(GA)=1%,酵母细胞与交联壳聚糖球的质量比m(Y):m(CB)0=0.5,交联时间为6h,固定化时间为18h,底物浓度为10mmol/L,在此条件下反应最大转化率和产物光学纯度分别高达67.86%和98.05%ee。固定化酵母壳聚糖球具有良好的重复使用性和贮存稳定性。

HPLC法测定L-(+)-扁桃酸的光学纯度

目的采用HPLC法测定L-（＋）-扁桃酸的光学纯度。方法采用Chirlcel OJ-H手性色谱柱,以正己烷-乙醇-三氟乙酸（96∶4∶0.3）为流动相,检测波长220 nm,流速1.0 m L·min-1,柱温30℃。结果 L-（＋）-扁桃酸与D-（-）-扁桃酸的分离良好,L-（＋）-扁桃酸0.2-1.2×10^3μg·m L-1与峰面积的线性关系良好（r=0.9998）,检测限为0.4 ng（S/N=3）,定量限为1.6 ng（S/N=10）。结论所用方法快速、准确、灵敏,适于L-（＋）-扁桃酸光学纯度的测定。

头孢尼西钠的合成

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)与5-巯基-1,2,3,4-四氮唑-1-甲基磺酸双钠盐(SMT-DS)在BF3作用下缩合,生成7-氨基-3-[甲磺酸基-1-H-四唑-5-基-巯甲基]-3-头孢烯4-羧酸(3)。3与D-(-)-甲酰基扁桃酸酰氯在pH6.5-7.0下酰化、盐酸作用下去甲酰基成头孢尼西酸,再与N,N-二苄基乙二胺二醋酸盐(DBED)结合生成头孢尼西胺盐(5)。5经酸化,成盐反应得头孢尼西钠。反应总收率为60.7%,所得产品纯度为98.7%(HPLC)。