D-扁桃酸脱氢酶和L-亮氨酸脱氢酶级联催化的L-苯甘氨酸对映选择性生物合成

L-苯甘氨酸是重要的手性非天然α-氨基酸,可广泛用于合成多种食品添加剂及药物中间体,探索其绿色合成工艺具有重要的意义。本研究将新型高活性的D-扁桃酸脱氢酶(LhDMDH)和L-亮氨酸脱氢酶(EsLeuDH)偶联,在辅酶内循环的前提下,仅需较低浓度的辅酶即可实现生物催化D-扁桃酸合成L-苯甘氨酸。通过对加酶量、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD^+)浓度、NH+4浓度和底物浓度等因素进行优化,获得了一个最经济的反应条件:200 mmol/L的D-扁桃酸、6.5 kU/L的加酶量、0.1 mmol/L NAD^+、0.5 mol/L NH4^+的条件下、30℃,反应12h,在此条件下,产物的得率和对映体过量(e.e.)值分别可达98%和99%以上,具有较大的产业化潜力,为实现L-苯甘氨酸规模化的生物合成奠定了坚实的基础。

酿酒酵母中的D-(-)-扁桃酸脱氢酶

酿酒酵母BY1.1b对苯乙酮酸不对称还原成D-(-)-扁桃酸的反应具有高度的催化还原活性和光学选择性。采用超声波细胞破碎、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析及Sephacryl S-200分子筛层析等步骤,从酵母BY1.1b中分离纯化得到D-(-)-扁桃酸脱氢酶。该酶的相对分子质量约60000。该酶的生物合成模式为非细胞生长偶联型和非底物诱导型。该酶与酵母醇脱氢酶、马肝醇脱氢酶、乳酸脱氢酶及丙酮酸脱氢酶的底物特异性具有显著差别,是一种新型的脱氢酶。

酿酒酵母by1.1b产D-(-)-扁桃酸脱氢酶的发酵条件优化

对一株产D-(-)-扁桃酸对映选择性脱氢酶的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae sp. strain by1.1b)发酵产酶条件进行了优化。研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成,结果为:蛋白胨60 g/L,麦芽糖30 g/L,MgSO_4 0.5 g/L,ZnSO_4 0.01 g/L, KCl 1.0 g/L。优化后酶产量提高了7.9倍(由2.56 U/mL增至20.21 U/mL)。摇瓶培养最佳条件为:装液量40%,发酵pH 6.5,接种量10%,发酵温度30℃。考察了细胞生长及产酶的时间进程,最佳培养时间为25 h。

酿酒酵母中D-(-)-扁桃酸脱氢酶性质研究

采用DEAE Sepharose离子交换层析、Butyl Sepharose疏水层析和Blue Sepharose亲和层析等分离方法,从高产D-（-）-扁桃酸的酵母菌株BY1.1b中纯化得到电泳纯的D-（-）-扁桃酸脱氢酶.采用Sephacryl S-200分子筛层析柱测得该酶的相对分子质量约60 kDa,用SDS-PAGE电泳测得该酶亚基分子量为32 kDa,表明该酶属于同型二聚体.该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0.该酶在低于30℃,pH5.5~8.0较为稳定.以NADH和苯乙酮酸为底物,其Km值分别为Km（NADH）=99.2μmol/L和Km（苯乙酮酸）=263.3μmol/L.