D-氨基酸氧化酶基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的探讨D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因多态性与精神分裂症的相关性。方法运用聚合酶链反应扩增及单核苷酸多态性的分子生物学技术,收集符合美国DSM-Ⅳ精神分裂症诊断标准的112个先证者及其父母组成的核心家系,对DAAO基因的rs3741775、rs3825251、rs3918347、rs4964770多态性分型,进行精神分裂症的DAAO基因多态性的关联分析和单体型相对风险率分析。结果 rs3918347等位基因与精神分裂症相关联(P=0.014),其中等位基因A是保护因素(Z=-2.37),G为危险因素(Z=2.37),A等位基因频率为0.41,G为0.59;rs3741775、rs3825251、rs4964770与精神分裂症无关联。三种单体型rs3825251-rs3918347的C/G、rs3918347-rs4964770的G/T、rs3825251-rs3918347-rs4964770中的C/G/T与精神分裂症有关联(P值分别为0.021、0.036、0.028,基因型频率分别为0.33、0.28、0.15)。结论 DAAO基因与精神分裂症相关联。

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。

D-氨基酸氧化酶基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的 :构建含D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因的重组逆转录病毒载体 ,初步观察DAAO基因的功能。方法 :利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体 (pLDAAOSN)中 ,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,将重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,观察 5 0mm/LD 丙氨酸对KDAAO杀伤作用。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证明重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6CFU/ml)。PCR、原位杂交分析证明DAAO基因已整合至KDAAO基因组中 ,并在mRNA水平表达。初步观察到D 丙氨酸能明显杀伤KDAAO。结论

D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的诱导表达

利用乳糖代替IPTG作为诱导剂,对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pWY中的D-氨基酸氧化酶进行诱导表达。分别研究了乳糖浓度、菌体浓度、诱导温度、诱导时间对DAAO酶活的影响。结果显示,当菌浓OD600达1.0左右、乳糖浓度为10 g/L、28℃下诱导约6 h,摇瓶发酵得到的DAAO酶活高达2 400 IU/L,在5 L自控式发酵罐上酶活达3784.32 IU/L,比摇瓶提高了1.57倍。

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因的克隆、测序及表达

利用跨越内含子的ＰＣＲ技术，从三角酵母（Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）变种ＦＡ１１０中扩增得到Ｄ氨基酸氧化酶基因（ｄａａｏ），并通过ＴＡ克隆的方法将其克隆至ｐＧＥＭＴ载体。序列测定结果表明，所得ｄａａｏ基因的５′端内含子已被删除，基因总长度为１０７１ｂｐ，它与Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓｖａｒｉａｂｉｌｉｓ的Ｄ氨基酸氧化酶同源性达９８３％，与Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ和Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｃｉｌｉｓ的同源性分别是３８９％和３０８％。为提高表达水平，又将此基因转移至高表达载体ｐＥＴ２８ｂ上，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达。经ＩＰＴＧ诱导，目的蛋白的产生量可占菌体总蛋白量的４６％，分子量约为３８ｋＤ。Ｄ氨基酸氧化酶的活力可达８０２ｕ／Ｌ。

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在毕赤酵母中的转化

利用跨越内含子的PCR技术,从三角酵母(Trigonopsisvariabilis)中扩增得到D-氨基酸氧化酶基因(DAAO),通过TA克隆的方法将其克隆至pBS-T载体,并转化大肠杆菌TOP10。序列测定结果表明,所得DAAO基因的5’端内含子已被删除,基因总长度为1071bp。之后将该基因与酵母表达载体pPIC3.5K连接,转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。

肝癌组织中D-氨基酸氧化酶基因表达的临床意义

目的探讨肝癌组织中D-氨基酸氧化酶(DAO)基因表达水平与其临床特征及预后的相关性。方法收集214例肝癌患者的肝癌组织的基因表达谱及相关临床数据,对DAO基因表达水平与其临床特征及预后进行单变量和多变量分析。结果单变量分析提示,DAO高表达组中,血AFP水平较低(P=0.001),结节数目较少(P=0.042),TNM分期较好(P=0.014),转移风险较低(P=0.001),且预后较好(P=0.011)。多变量分析发现,DAO高表达组中,血AFP水平较低(OR为0.162,95%CI为0.078~0.336),转移风险较低(OR为0.140,95%CI为0.069~0.284),且预后明显优于低表达组患者(OR为0.833,95%CI为0.700~0.992)。结论肝癌组织中,DAO表达水平与患者血AFP水平、转移风险及预后相关,其高表达是肝癌的保护性因素之一。

IRES序列连接的D-氨基酸氧化酶与绿色荧光蛋白基因导入K562e细胞的表达

内部核糖体进入位点 (IRES)序列来源于脑心肌炎病毒 ,它可翻译一条mRNA上的两个开放读框 ,由其连接的两个基因的表达率相同。本实验应用以IRES序列连接D 氨基酸氧化酶 (DAAO)和绿色荧光 (GFP)基因构建的逆转录病毒载体 ,转染K5 6 2e细胞获得稳定表达GFP的单克隆细胞KDfGC和KDfGd,测定转基因细胞的荧光阳性率以及荧光强度 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。结果表明 ,KDfGC和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .6 4 % ,96 .31% ;2× 10 4细胞的荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。GFP荧光强度与H2 O2 的产量间呈指数相关。结论 :IRES序列调控的双基因可同时表达 ,GFP的荧光强度可以间接地反映DAAO基因的表达水平 ,为了解目的基因表达水平高低提供了新的方法。

基因工程酵母菌来源的D-氨基酸氧化酶分离纯化

目的 以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。 方法 采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经 DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephaciyl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的DAAO。结果 超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含 的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12 000 U／mi,。两步硫酸铵沉淀能粗分DAAO,50％硫酸铵沉 淀酶回收率可达85％以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达 90％,SDS-PAGE显示单一蛋白条带。结论 本实验方法能得到电泳纯的DAAO,总回收率约为40％。

中国汉族男性人群D-氨基酸氧化酶激活剂基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的研究中国男性群体中D-氨基酸氧化酶激活剂(DAOA)基因多态性与精神分裂症的相关性。方法采用等位基因特性PCR方法对272例男性精神分裂症患者和206例对照DAOA基因区域的3个单核苷酸多态性位点(SNP:rs778294,rs778293和rs3918342)进行基因分型和统计分析。结果 DAOA基因区域rs778294的一个等位基因(C)与精神分裂症显著相关(P=0.03)。由3个SNP构建的单倍型分析表明,单倍型CAT在病例-对照组中表现出显著的差异。结论在中国汉族男性群体中,DAOA基因可能是精神分裂症的一个易感基因,NMDA受体途径可能是发生精神分裂症的一个重要潜在因素。

基因工程菌表达D-氨基酸氧化酶研究进展

用分子克隆手段获得D 氨基酸氧化酶基因后 ,对其在不同表达系统如大肠杆菌系统、酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母、博伊丁假丝酵母。

D-氨基酸氧化酶在砷致仔鼠学习记忆损伤中作用的研究

目的:探讨D-氨基酸氧化酶(DAAO)在砷所致仔鼠学习记忆损伤中的作用。方法:建立仔鼠砷暴露模型(60 mg/L NaAsO_(2)),出生后6周的仔鼠腹腔注射DAAO的抑制剂6-氯苯并[d]异恶唑-3-醇(CBIO)(30 mg/kg)干预2周,Real-time RT-PCR测定DAAO、突触素(SYP)和突触后致密物95(PSD95)mRNA表达水平,UHPLC-MS/MS法测定D-丝氨酸和L-丝氨酸水平。结果:与对照组比较,NaAsO_(2)组仔鼠海马DAAO mRNA表达水平升高而SYP和PSD95 mRNA表达水平下降(P<0.05),D-丝氨酸和L-丝氨酸水平下降(P<0.05);与NaAsO_(2)组比较,NaAsO_(2)+CBIO组仔鼠海马DAAO mRNA表达水平下降而SYP mRNA表达水平升高(P<0.05),D-丝氨酸水平升高(P<0.05)。结论:砷暴露可使仔鼠海马D-丝氨酸水平降低和DAAO转录水平升高,抑制DAAO水平可使D-丝氨酸和突触相关蛋白SYP水平升高,从而可能改善砷暴露所致的仔鼠学习记忆损害。

三角酵母D-氨基酸氧化酶的固定化研究

通过共价结合的方法把三角酵母 D-氨基酸氧化酶 (DAO)分别固定在三种大孔高聚物和二种多糖的载体上 ,结果表明多糖类载体壳聚糖和 Sepharose4B比高聚物更能有效地固定化 DAO。经过固定化后 ,壳聚糖和环氧载体Epecust固定化酶对温度和 p H的稳定性提高 ,表观米氏常数增大。在分批式头孢菌素 C氧化脱氨的反应中 ,固定化酶表现出良好的操作稳定性 ,戊二酸单酰基 - 7-氨基头孢霉烷酸的得率为 93%。

D-氨基酸氧化酶/D-丙氨酸系统杀伤K562e细胞的作用机制探讨

目的 :探讨 D-氨基酸氧化酶 (DAAO) / D-丙氨酸 (D - Ala)系统用作自杀基因治疗白血病的作用机制。方法 :以 D- Ala杀伤稳定表达 DAAO和绿荧光蛋白 (GFP)的高致瘤性 K 5 6 2 e单克隆细胞 KDf Gd、KDf GC,应用 MTT法检测细胞存活率 ,并用酚红氧化法测定培养上清 H2 O2 和 L owry法测定细胞蛋白数量 ,流式细胞仪测定细胞 GFP的荧光强度。结果 :在 2 5 m mol/ L D-Ala作用下 2 4 h即可完全杀死 KDf Gd细胞 ,当 D- Ala为 2 0 mmol/ L 时延长作用时间至 4 8h,杀伤率由 6 4 %增加至 96 .8% ,而D- Ala≤ 15 mm ol/ L 时杀伤率增加不明显。低于 2 0 m mol/ L,D- Ala对 K5 6 2 e几乎无杀伤作用。培养上清的 H2 O2 变化与杀伤转基因细胞作用相一致。 结论 :DAAO/ D- Ala系统可能是通过产生 H2 O2 发挥杀伤转基因 K5 6 2

绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D

D-氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较

D 氨基酸氧化酶 (DAAO)在转化头孢菌素C生产 7 ACA和转化DL 氨基酸制备α 酮酸和L 氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术 ,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC3 5K上 ,再将表达质粒pPIC3 5K DAAO分别整合P .pastoris的宿主细胞KM71和GS1 1 5 ,经筛选获得阳性重组菌PDK1 3(MutS)和PD2 7(Mut+ )。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示 :PDK1 3(MutS)株比PD2 7(Mut+ )株消耗甲醇慢、诱导时间长 ,但对通气量要求低、表达水平高 ,摇瓶活力分别达到 2 70 0和 2 5 0 0IU L ,1 4L发酵罐内活力分别达到 1 0 1 4 0和 84 6 3IU L。初步探索了DAAO对DL 苯丙氨酸的拆分 ,结果显示基因工程菌表达的DAAO具有良好的转化DL 苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO(TvDAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时,目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右,比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍;但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时,DAAO酶活达到了3.24u/mL,比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。

D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化

目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶(DAAO)的新方法,以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7ACA)。方法通过基因工程手段,构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒,电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞,利用PCR方法筛选阳性转化子,再经甲醇诱导筛选出高表达菌。结果高表达重组菌(PHD12)摇瓶发酵单位达到2 000 IU/L,发酵罐内达到22 500 IU/L。并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化,以60%的总收率获得纯化产物。纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性。结论利用基因工程表达组氨酸标记蛋白,可简化基因工程的下游工序。

D型氨基酸氧化酶活性对于D-硝基精氨酸手性转化的影响

D-硝基精氨酸(D-NNA)可在大鼠体内发生手性转化生成其L型异构体,即L-NNA,后者可抑制一氧化氮合酶活性,减少一氧化氮生成,升高动脉血压.研究了D型氨基酸氧化酶(DAAO)在D-NNA手性转化中的作用及DAAO对不同(包括已报道在体内可发生手型转化的)D型氨基酸的选择活性.体内实验显示,DAAO的选择性抑制剂苯甲酸钠(400mg/kg)或肌酐(400mg/kg)均可在不同程度上抑制D-NNA升压作用,进一步研究发现,肾脏或肝脏DAAO酶液在外加DAAO后可提高D-NNA的手性转化约2倍,表明DAAO对于D-NNA在体内的手性转化是必需的.DAAO酶液对可在体内发生手性转化且转化率相似(30%～50%)的D型氨基酸(D-Phe,D-Leu和D-NNA)的选择性表现出显著差异(Kcat/Km相差可达约15倍左右),这从另一方面表明体内D-硝基精氨酸氧化是其发生手性转化的前提条件但非决定因素.

D-氨基酸氧化酶的研究进展

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅基的典型的黄素蛋白酶类。DAAO可氧化D-氨基酸生成相应的酮酸和氨。介绍了D-氨基酸氧化酶的研究现状,包括在自然界的分布、生理功能、生物学特性、催化机理、基因克隆和序列分析以及基因表达。