聚醚功能化离子液体辅助不对称氢化合成D-泛解酸内酯

为了解决手性催化剂在不对称氢化中难以循环利用的问题,本研究基于氨基酸和咪唑鎓盐离子液体修饰的手性吡咯烷基双膦配体,采用聚醚胍盐离子液体辅助铑催化酮基泛解酸内酯均相不对称氢化合成D-泛解酸内酯。研究了铑催化剂前体、双膦配体结构、溶剂效应和聚醚离子液体掺杂对催化活性和对映选择性的影响。基于筛选出的最佳双膦配体,构建出“均相催化-液/固分离”体系用于手性催化剂的分离和循环。结果表明:该催化体系表现出较高的催化活性、对映选择性和长期稳定性,经过5次循环后未见催化性能有明显下降,为不对称氢化合成D-泛解酸内酯的可行性提供了理论和实验依据。

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体MutE861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH6.0和pH5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体MutE861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体MutE861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。

化学酶法合成D-泛解酸内酯的研究进展

泛酸俗称维生素B5,是辅酶A合成的前体,而D-泛解酸内酯是D-泛酸合成的前体。D-泛解酸内酯的化学合成是以甲醛和异丁醛为起始原料,经醛缩合、腈化及内酯化等反应生成DL-泛解酸内酯,再经选择性拆分得到D-泛解酸内酯。化学法与酶法相结合有助于高效、绿色地合成高光学纯度的D-泛解酸内酯。内酯水解酶催化混旋泛解酸内酯的选择性拆分已经成功地实现了工业生产。对羰基还原酶、醇脱氢酶和羟基腈裂合酶等在化学酶法合成D-泛解酸内酯中的最新进展进行了综述。

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D 泛解酸内酯水解酶的菌株 ,经鉴定为串珠镶孢霉菌 (Fusariummonili forme)SW 90 2。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始pH8 0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L发酵罐中通风发酵 45h ,产菌丝体生物量 7 1 8g干菌体 L ,D 泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 92IU

微生物酶拆分方法生产D-泛酸的手性中间体D-泛解酸内酯

筛选到一株产D -泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌 (FusariummoniliformeSW -90 2 )。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始 pH8.0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L和 10 0 0L发酵罐中通风发酵 4 5～ 4 7h ,产酶量为 6～ 8g干菌体 /L ,D -泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 .87～ 0 .92IU/g干菌体。该酶的最适反应温度为 5 5℃ ,最适反应 pH为 7.0～ 7.5。在酶不对称水解泛解酸内酯过程中 ,对溶液加酶量 5 %～ 10 % ,底物浓度 10 %～ 2 0 % ,控制水解率 2 0 %～ 30 % 。

D-泛解酸内酯水解酶的固定化及酶学性质

为有效提高D-泛解酸内酯水解酶的利用效率,笔者选择合适的载体对酶进行固定化,在优化固定化条件的同时研究固定化酶的最佳反应条件和酶学性质。结果表明,选择的最佳固定化载体为树脂D380,最佳固定化条件为:酶的吸附添加量为30 U(以1 g湿树脂计),吸附pH 7.0,吸附温度30℃,吸附时间5 h,戊二醛体积分数0.1%,交联时间1 h。在最优条件下得到的固定化酶的比酶活为(11.5±0.12) U/g。固定化酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.5。游离酶和固定化酶的动力学常数K_m分别为170.25和207.60 mmol/L。Ca^(2+)对酶促反应有激活作用,Mn^(2+)对该酶有较强的抑制作用。

重组表达D-泛解酸内酯水解酶乳酸克鲁维酵母的发酵工艺优化

以前期构建的重组表达D-泛解酸内酯水解酶的乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)GG799为对象,在5 L发酵罐中,基于考察pH、搅拌转速、接种量3种单因素条件对产酶的影响结果,进一步优化补料策略,初步确定了促进重组D-泛解酸内酯水解酶高效表达的补料发酵方式。单因素条件研究结果表明,当pH 6.0、搅拌转速300 r/min、接种量2%时,可以获得最高表达水平,酶活力达5.12 U/mL,较摇瓶最佳结果提高了2倍。补料发酵研究表明,当通过补料维持发酵液恒糖质量浓度为5 g/L时,酶活力可达到8.20 U/mL,较分批发酵酶活力提高了60.1%;当分批发酵结束后,以恒速5 g/h进行补料,酶活力最高可达10.70 U/mL,较恒糖补料方式酶活力提高了30.5%,较分批发酵酶活力提高了98.6%。通过分批发酵和补料分批发酵的研究,显著提高了D-泛解酸内酯水解酶的酶活力,为进一步放大生产奠定了基础。

吸附-交联法固定D-泛解酸内酯水解酶的研究

选择6种吸附树脂和离子交换树脂对D-泛解酸内酯水解酶进行固定化,筛选出了固定化效果较好的大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂D-380为载体,用先吸附后交联的方法固定化。通过实验对固定化条件进行了优化,得出最佳的固定化条件为:加酶量6 U/g树脂、吸附pH 7.5、吸附时间4 h、吸附温度30℃、交联剂戊二醛终浓度0.1%、交联时间2 h。实验表明在此条件下制得的固定化酶有很好的稳定性:固定化酶在连续20次的底物水解反应后,剩余酶活达到71%。当温度达到80℃时游离酶几乎失去酶活,而固定化酶剩余酶活为60%以上。游离酶的pH稳定性范围为pH 7～8,而固定化酶为pH 6.5～8.5。

诱变选育D-泛解酸内酯水解酶高产菌及发酵条件优化

该文以实验室筛选得到的一株具有D-泛解酸内酯水解酶活力的镰孢霉菌(酶活力为1.42 U/mL)为出发菌株,先后利用常温室压等离子(atmospheric room temperature plasma,ARTP)和紫外-氯化锂(UV-LiCl)技术,对其进行了4轮递进诱变选育,以筛选得到高活性D-泛解酸内酯水解酶菌株。实验得到ARTP诱变的最佳处理时间为80 s,UV-LiCl诱变的最佳处理时间为80 s(6 g/L LiCl)。通过变色圈大小初筛和摇瓶复筛,最终筛选得到一株酶活力达3.46 U/mL的菌株4-80-6,酶活力较出发菌株提高了143.66%,并且通过8次传代培养,该菌株遗传性较为稳定。以20%的底物浓度催化反应时,突变株4-80-6水解率由原始菌11.6%提高到17.1%,光学纯度由93.5%提高到98.3%。对突变株4-80-6菌株进行发酵条件优化,得到最佳产酶条件为:培养温度25℃,培养基初始pH 8.5,接种量10.5%,培养时间48 h,该条件下酶活力为4.33 U/mL,比优化前提高了25.14%。研究结果为DL-泛解酸内酯酶法拆分的工业应用提供了一种有效策略。

固定化细胞拆分DL-泛解酸内酯的初步研究

用卡拉胶包埋串珠镰孢霉菌FusariummoniliformeSW - 90 2菌丝体 ,得到D -泛解酸内酯水解酶活力较高的固定化细胞。与游离细胞相比较 ,固定化细胞酶活随 pH变化的范围以及对温度适应的范围大致与游离细胞相仿。用固定化细胞进行反复分批酶水解 30批 ,每天一批 ,酶活稳定 ,平均水解率 2 8.0 %。固定化细胞冰箱 (4℃ )贮存 8周 ,酶活未见下降。

微生物法生产D-泛酸钙手性中间体D-泛解酸内酯

项目需求：目前D-泛酸钙的生产采用后拆分的工艺，产品生产周期长、成本高。采用生物酶法进行前拆分生产D-泛解酸内酯，然后与β-氨基丙酸直接合成D-泛酸钙的工艺可以大大降低生产成本，所要达到的经济技术指标如下：水解收率40％。

海藻酸钠复合载体固定化细胞拆分D,L-泛解酸内酯

研究了海藻酸钠及其与聚丙烯酰胺(PAM)和聚乙烯醇(PVA)的复合载体对镰孢霉菌(Fusarium oxyspo-rumBU-11)细胞的固定,该固定化细胞被用于手性拆分D,L-泛解酸内酯的反应体系。实验表明,海藻酸钠固定化细胞具有较好的扩散性和强度,在水解试验中与游离细胞相比,酶活收率可达到80%以上,而且具有较好的温度和批次反应稳定性,在底物质量浓度为200 g/L的3 L搅拌式反应器中6 h水解反应20批,水解率可以保持在初始的80%左右。PVA和PAM的加入可增强固定化细胞的强度,前者对酶活影响不大,后者使酶活略有增加。

泛解酸内酯拆分新工艺研究

研究了拆分泛解酸内酯的新工艺 ,拆分所用手性试剂为自己开发研制的L -DMPA。

细菌纤维素固定化酶的制备及其水解拆分性能

经D-泛解酸内酯酶(D-Lacs)催化水解拆分是制备医药中间体D-泛解酸的绿色催化新技术,但游离酶存在价格昂贵、易失活、难分离等问题。利用椰果源细菌纤维素(BC)的三维纳米纤维网络为支架,以二乙烯三胺将其改性成BC-NH2,吸附纳米酶后,以戊二醛稳定D-泛解酸内酯水解酶固定于BC网络中。结果表明,氨基化修饰改性提高了BC固定化酶的活性,BC-NH2固定化D-Lacs的酶固载量高达372.5 mg/g,约4.5 h即可完成D,L-泛解酸内酯的水解拆分,均高于未改性BC。经过10次回收循环水解拆分实验,均可保证每批次2 h即可达到一半水解率,是一种有前景的全生物基酶固定化技术。