D-环丝氨酸促进大鼠条件性恐惧消退记忆的长期保持

目的研究D-环丝氨酸(D-serine,DCS)对条件性恐惧消退记忆的长时保持的影响。方法成年雄性SD大鼠40只,采用完全随机方法分为空白对照组、消退对照组、消退训练组、消退训练前DCS干预组、消退训练后DCS干预组,每组8只。在消退训练后3 d时进行僵立行为测试与旷场行为测试。结果①消退训练组的僵立时间百分比[(39.77±22.69)%]显著低于消退对照组[(61.46±11.10)%](P<0.05),但仍高于空白对照组[(2.82±1.27)%](P<0.01);旷场测试中消退训练组的中央路程百分比及直立次数[(2.82±2.89)%,(7±4)]显著高于消退对照组[(0.50±0.84)%,(3±4)],但低于空白对照组[(19.29±6.08)%,(20±6)](P<0.05);②消退训练后DCS干预组的僵立时间百分比与旷场行为测试成绩与其他组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论消退训练后给予D-环丝氨酸能够促进条件化恐惧消退记忆的长时保持。

D-环丝氨酸对大鼠空间工作记忆的影响

目的:探讨D环丝氨酸对空间工作记忆损伤大鼠的治疗作用。方法:随机将32只大鼠分为4组:对照组、阿托品损伤组、生理盐水治疗组和D环丝氨酸治疗组,分别给予相应的药物处理后,训练动物学习水迷宫中延缓的位置非匹配作业,以大鼠选择游泳时的选择正确率及逃避潜伏期为评判标准。结果:阿托品损伤组大鼠的选择正确率显著降低(P<0.01),而逃避潜伏期无改变(P>0.05);D环丝氨酸治疗组大鼠在作业的最初3天,选择正确率明显提高(P<0.01),但自第4天起效果不明显(P>0.05);整个过程中逃避潜伏期无改变(P>0.05)。结论:D环丝氨酸对空间工作记忆损伤大鼠有短期治疗作用,长期用药后效果不明显。

D-环丝氨酸的合成

以D-丝氨酸为原料,经酰化、缩合、环合、脱保护4步反应制得D-环丝氨酸,总收率为58.3%。目标产物的化学结构经红外、核磁共振氢谱等确证,纯度经HPLC测定,含量达98.8%。

D-环丝氨酸抑制铜绿假单胞菌群体感应活性研究

目的以铜绿假单胞菌模式菌株PAO1为研究对象,研究抗结核药物D-环丝氨酸通过靶向抑制病原菌群体感应(quorum-sensing,QS)系统实现抑制病原菌毒力发挥的新应用潜力。方法用不同浓度的D-环丝氨酸处理铜绿假单胞菌,通过系列表型实验结合荧光定量PCR以评估D-环丝氨酸对群体感应所调节的毒力因子和相应基因表达的影响,并利用秀丽隐杆线虫感染模型评估D-环丝氨酸对铜绿假单胞菌毒力抑制的体内活性。结果 D-环丝氨酸表现出良好的铜绿假单胞菌生物膜、绿脓菌素以及蛋白水解酶抑制活性,显著抑制了QS系统调控基因和下游功能基因的表达,并且可以显著提高秀丽隐杆线虫在铜绿假单胞菌感染过程的存活率。结论 D-环丝氨酸可以有效抑制铜绿假单胞菌群体感应系统,有望开发成功的抗生素替代药物。

以结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶为靶点的抗结核药物筛选及其与D-环丝氨酸的共结晶

【目的】阐释结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶原有抑制剂D-环丝氨酸的作用机制,建立丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选模型,并用此模型筛选到新的抑制剂分子。【方法】将结核分枝杆菌中丙氨酸消旋酶基因克隆到pET-28a表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到可溶性的大量表达。表达后的蛋白质通过镍离子亲和层析和阴离子交换层析得到纯化,一方面将纯化后的蛋白和D-环丝氨酸共结晶以解析其抑制剂作用的分子机制。另一方面建立并优化丙氨酸消旋酶抑制剂的高通量筛选体系,用D-环丝氨酸验证体系的可行性并用该体系筛选本实验室药物库中的384种小分子片段、792种化合物及2 200种中药样品。【结果】得到的共晶晶体衍射能力2.50?,晶体空间群为P41212,晶胞参数a=b=163.92?,c=57.44?。结构分析表明,D-环丝氨酸进入活性位点之后与磷酸吡哆醛相互作用形成磷酸吡哆胺,使得磷酸吡哆醛的C4?原子与K42之间的相互作用被破坏,从而改变了结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶的活性中心氢键网络。同时经D-环丝氨酸验证建立的抑制剂筛选体系可行,获得阳性化合物分子2个。【结论】依据我们所建立的高通量筛选体系可以有效地为结核分枝杆菌丙氨酸消旋酶筛选到可信的抑制剂分子。

D-4-氨基-3-噁唑烷酮的合成研究

以D-丝氨酸为起始原料,经酯化、酰胺化、氨解、环合、水解脱保护基五步反应合成D-环丝氨酸,反应总收率48.0%。目标产物化学结构经红外、核磁共振氢谱等确证,纯度经HPLC测定含量达98.6%。

变异链球菌丙氨酸消旋酶基因表达纯化及活性测定

变异链球菌是口腔主要的龋病病原菌。丙氨酸消旋酶通过合成右旋丙氨酸(D-alanine,D-ala)参与细菌细胞壁肽聚糖的生物合成过程,与细菌性疾病密切相关,近年来成为抗菌药物的又一理想靶位。D-环丝氨酸(D-cycloserine,DCS)是丙氨酸消旋酶不可逆性抑制剂。本研究通过聚合酶链反应克隆变异链球菌UA159的smu.1834c基因,经过酶切、连接,构建重组表达质粒pET-smu.1834c,诱导表达重组,纯化蛋白。测定DCS对丙氨酸消旋酶活性的抑制作用。成功诱导表达纯化smu.1834c基因编码蛋白,具有体外催化L-丙氨酸生成D-丙氨酸的活性。发现DCS能够抑制该蛋白的活性。本研究证实变异链球菌smu.1834c基因编码丙氨酸消旋酶。DCS能够抑制其活性,并且呈现一定的剂量相关性。