高稳定液态D-阿洛酮糖3-差向异构酶制剂研究

为解决D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAE)衰减过快、贮运成本高的问题,拟开发一款具有良好存贮稳定性的DEA液态酶制剂。以半衰期为评价依据,通过单因素试验筛选出对半衰期影响显著的4个因素,并进一步利用响应曲面法对酶制剂的配方进行优化。结果表明:稳定DAE酶制剂的最佳配比为0.1mol·L^(-1)CaCl_(2)、3.96%海藻糖、41.68%葡萄糖、29.32%PEG-400。在此条件下,半衰期为292天,与模拟理论值的相对误差仅为0.17%。通过工艺优化,将DAE的储存时间大幅延长,提高了酶制剂的贮运性能。

重组大肠杆菌发酵条件优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的研究

功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得了最佳的培养基组合:蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO_(4)3 g/L、KH2PO_(4)3 g/L、MgSO_(4)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 mmol/L。在此基础上,利用单因素试验对培养条件进行研究,确定了最佳发酵诱导时间(10 h)、接种量(3%,摇瓶)、装液量(30%)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加浓度(1 mmol/L),使OD_(600)增加了1.46倍,酶活提高了2.57倍。在此基础上,利用5 L发酵罐进行放大发酵实验,确定了最佳诱导时间。在最佳条件下,经过18 h的诱导发酵,菌体OD_(600)最高值达51.8,干重达到21.5 g/L,酶活达到103.8 U/mL。当细胞添加量为0.014 g DCW/L时,以500 g/L D-果糖为底物,pH为7,50℃,1 h转化率达28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可达149.74 g/L。该研究对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵生产具有参考价值。

D-阿洛酮糖曲奇饼干工艺优化及品质分析

以传统曲奇饼干制作工艺为基础,研制符合大众需求的D-阿洛酮糖曲奇饼干,并获得最佳制备工艺。通过水分活度分析、质构分析、成像分析、松密度分析以及感官评价研究了不同D-阿洛酮糖添加量对曲奇饼干品质的影响。结果表明:与纯蔗糖曲奇饼干相比,添加适量D-阿洛酮糖可改善饼干表面色泽,使曲奇饼干内部气孔细密均匀,降低饼干的硬度、脆度和咀嚼性,提高饼干的滋味与口感。当D-阿洛酮糖量与蔗糖量比值为12∶19时,曲奇饼干质构特性最好,组织结构呈明显的焦糖色,且感官评分最高。

D-阿洛酮糖的应用特性研究综述

D-阿洛酮糖作为一种新型代糖,具有低热量、低代谢率、降血糖、抑制脂肪堆积、预防肥胖、保护神经等生理功能。因其具有特别的生理特性、口感纯正、安全性高、可改善产品品质等优势,所以被认为是蔗糖的理想替代物。本文综述了D-阿洛酮糖在食品、医药、日化、生物等领域中应用。

D-阿洛酮糖的结晶工艺优化

为完善D-阿洛酮糖结晶工艺,本研究以D-阿洛酮糖结晶后的目数分布及晶体形态为指标,优化了D-阿洛酮糖浓度、晶种量、蒸发水量、搅拌转速以及降温频率。结果表明,阿洛酮糖的最优结晶工艺为D-阿洛酮糖浓度76%、晶种添加量1.4%、蒸发水量83 g·h^(-1)、搅拌转速16 r·min^(-1)和降温频率0.4℃·h^(-1),此条件下结晶收率较高,晶体晶型良好。

D-阿洛酮糖的生物转化及冷却结晶工艺优化

D-阿洛酮糖作为一种具有多重生理功能的食品添加剂,是近年来的研究热点。为完善D-阿洛酮糖上下游生产工艺,选取3种不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差相异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行异源表达,通过对全细胞生物转化工艺的探索和不同重组菌催化能力的分析对比,发现重组表达了来源于多尔氏菌属(Dorea sp.CAG317)的DAEase的全细胞生物转化率达到32.60%。在此基础上对反应液进行色谱分离和纯化,得到高纯度的D-阿洛酮糖料液。对D-阿洛酮糖料液采取冷却结晶法析出晶体,结果显示采用优化后的冷却结晶工艺,D-阿洛酮糖结晶率达到了77.43%,纯度达到了98.70%。该研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供重要参考。

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶法规标准及工艺研究进展

对国内外D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的法规标准情况进行研究比较,汇总了在北美、澳新、欧盟等地区行政许可的情况,阐述了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在我国的申报审批情况以及中国申报食品添加剂的流程办法,并梳理国内外工艺进展,为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的资源化利用和应用研究提供理论依据与参考,同时促进D-阿洛酮糖产业发展。

D-阿洛酮糖生物合成研究进展

D-阿洛酮糖具有低热量、低吸收特点,是目前最具市场和研究价值的具有保健功能的稀有糖,其安全性已经得到包括美国食品药品监督管理局在内的多国监管机构的认可,可以用于食品。文章简述了D-阿洛酮糖的生理功能及应用,介绍了D-阿洛酮糖生物合成过程中涉及的生物酶、生物转化过程、产品分离纯化和结晶的方法,讨论分析了当前D-阿洛酮糖生产过程的瓶颈问题,并提出可能的解决措施。

D-阿洛酮糖的生理功能及应用研究进展

D-阿洛酮糖,作为D-果糖的C-3差向异构体,是一种新型低热量甜味剂。目前多项研究已证明D-阿洛酮糖的食用安全性,且其已被美国食品和药物管理局批准用于食品行业。D-阿洛酮糖不仅能够作为低热量甜味剂用于饮料和膳食补充品中,还因其具有预防肥胖、糖尿病、动脉粥样硬化等生理功能,在健康、医疗等方面有着巨大的应用价值和潜力。该文就D-阿洛酮糖的理化性质、合成方法和其降血糖、减脂、抗动脉粥样硬化、抗氧化、神经保护等生理功能以及在食品和医疗领域的应用进行综述。

枯草芽孢杆菌全细胞转化高效合成D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明:启动子PylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5 mmol/L Mg^(2+)。采用全细胞方法以500 g/L D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖,4 h内反应基本达到平衡,转化率为30.06%。研究旨在为D-阿洛酮糖工业规模化生产提供实验基础和理论依据。

D-阿洛酮糖在食品应用领域行政许可进展

阐明了D-阿洛酮糖在进入食品应用领域行政许可方面的进展。行政许可是完成D-阿洛酮糖技术开发和进入民众餐桌之间的关键环节。介绍了D-阿洛酮糖的发展历程,分析总结了D-阿洛酮糖在美洲、日韩、澳新、欧盟等地区行政许可的情况,阐述了D-阿洛酮糖在我国申报新食品原料的内在逻辑、整体流程,并详细介绍了我国申报D-阿洛酮糖作为新食品原料的进度,为我国D-阿洛酮糖行业的发展提供了参考依据。

基于JMP软件分析的D-阿洛酮糖结晶工艺研究

目的:基于JMP软件分析D-阿洛酮糖结晶工艺,建立一种可高效从糖浆中回收D-阿洛酮糖的结晶方法。方法:首先,利用动态法测定了D-阿洛酮糖在溶剂中的溶解度,确定结晶溶剂种类。其次,通过单因素实验确定结晶初始条件;通过JMP软件设计部分析因实验,并考察降温速率、搅拌速率与晶种添加量对结晶收率的影响。最后,采用JMP软件分析工艺过程,建立结晶收率预测模型,确定最优的结晶工艺条件。结果:基于JMP软件分析D-阿洛酮糖结晶工艺,建立了收率预测模型,并预测得到最佳的结晶条件为:起始温度60℃,终止温度20℃,浆醇比2∶1,搅拌转速300 r/min,降温速率1.5℃/h,晶种添加量10%。该条件下结晶收率达91.36%,与预测值92.85%无显著性差异,且晶体质量良好。

海藻酸钠固定细胞产D-阿洛酮糖的研究

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用海藻酸钠作为载体,包埋重组大肠杆菌催化D-果糖生成D-阿洛酮糖。以固定化细胞的酶活活力回收率为指标,优化出最佳固定化条件为:海藻酸钠浓度3%,细胞包埋量60g/L,Ca Cl2浓度2%,固定化时间4h,0.01%浓度戊二醛溶液中交联4h。该条件下所得固定化细胞的酶活回收率高达76%,且具有较好的操作稳定性,重复操作8次后酶活回收率仍然保持61%。固定化后DPE细胞的最适酶反应温度提高了5℃、最适pH与游离细胞基本一致,耐热性明显提高,p H稳定性与游离细胞一致。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。

壳聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-果糖。实验结果表明:固定时间为3h,酶∶载体=15∶1(U/g),其酶活回收率达到45%。相比游离酶,固定化酶具有更高的温度稳定性以及在较宽的pH范围内保持较高酶活,其最适温度和pH分别为60℃与8.5。固定化酶在填充床中反应的最高转化率为24%,在最佳流速2.5mL/min下其转化率为19%,相关产率为6.7g/L·h,经过168h的反应,其转化率仍然保持在13%以上。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co^(2+)、Mn^(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。

L-鼠李树胶糖激酶在D-阿洛酮糖合成中的应用

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose-3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的可逆反应,但D-阿洛酮糖的产率较低。L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)具有磷酸化酮糖类物质的活性,将其与DPE偶联,可以打破DPE的可逆平衡,从而提高D-阿洛酮糖的产率。在反应体系中引入多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),可实现ATP的再生,降低反应的成本。本实验在大肠杆菌Rosetta(DE3)中分别过表达DPE、RhaB和PPK,优化其反应条件,计算产物得率。结果表明,RhaB的相对分子质量约为5.3×104,最适pH和温度为8.0和35℃。将DPE和RhaB偶联,最适条件如下:pH 8.5,温度35℃,最适金属离子Mg2+,DPE和RhaB酶量比(质量比)1∶2,产物得率为70%。将DPE、RhaB和PPK偶联,ATP浓度降为D-果糖的1/5,D-阿洛酮糖得率为50%。本研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供理论依据。

生物法生产D-阿洛酮糖的研究进展

D-阿洛酮糖(D-psicose或D-allulose)是一种零热量的功能性稀少糖,具有控血糖、保护胰岛、抗氧化等诸多功效。在广泛调研的基础上,本文总结了D-阿洛酮糖的理化性质,生产关键酶D阿洛酮糖3差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)和D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,DTE)的研究进展,探讨了生物法合成D-阿洛酮糖的工艺方法,分子手段改造DPE和DTE的研究成果以及D-阿洛酮糖的分离纯化方法,并就当前D阿洛酮糖的研究现状与发展前景进行了展望。

利用重组大肠杆菌和马克斯克鲁维酵母高效催化合成D-阿洛酮糖

提出了一种高效、低成本的两阶段生产D-阿洛酮糖的生产工艺。第一阶段,构建异源表达Flavonifractor plautii D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组大肠杆菌用于转化果糖,实现D-阿洛酮糖的全细胞生物合成。重组大肠杆菌在pH 7.5、65℃条件下反应最优,且在不添加金属离子、60℃反应条件下半衰期达到2.7 h,具有高热稳定性。在添加干重2.4 g/L重组大肠杆菌的D-果糖纯水溶液中,产物D-阿洛酮糖的终质量浓度为231 g/L,转化率达到33%。在添加硼酸根离子的条件下,D-阿洛酮糖的终质量浓度为378 g/L,转化率可以达到63%。在第二阶段,利用马克斯克鲁维酵母消耗混合体系中的D-果糖生产乙醇,降低分离成本。在不添加任何营养物质的情况下,在2种不同体系内,D-果糖均可以完全被消耗并产出约0.4 g/g的乙醇。该文研究结果为D-阿洛酮糖的低成本工业化生产奠定了良好的基础。

生物转化生成D-阿洛酮糖的类球红细菌的筛选

对鱼塘淤泥、水样中富集分离的27株光合细菌的静止细胞反应产物,采用高效液相色谱进行分析,从中筛选到1株D-阿洛酮糖产率较高的菌株,在形态和常规生理生化方面鉴定的基础上,结合16S rDNA序列分析鉴定为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides),定名为类球红细菌SK011。SK011利用D-果糖(36 g/L,pH7.5)为底物进行静止细胞转化,45℃,5 h,D-阿洛酮糖产率达到6.54%。