高稳定液态D-阿洛酮糖3-差向异构酶制剂研究

为解决D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAE)衰减过快、贮运成本高的问题,拟开发一款具有良好存贮稳定性的DEA液态酶制剂。以半衰期为评价依据,通过单因素试验筛选出对半衰期影响显著的4个因素,并进一步利用响应曲面法对酶制剂的配方进行优化。结果表明:稳定DAE酶制剂的最佳配比为0.1mol·L^(-1)CaCl_(2)、3.96%海藻糖、41.68%葡萄糖、29.32%PEG-400。在此条件下,半衰期为292天,与模拟理论值的相对误差仅为0.17%。通过工艺优化,将DAE的储存时间大幅延长,提高了酶制剂的贮运性能。

重组大肠杆菌发酵条件优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的研究

功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得了最佳的培养基组合:蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO_(4)3 g/L、KH2PO_(4)3 g/L、MgSO_(4)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 mmol/L。在此基础上,利用单因素试验对培养条件进行研究,确定了最佳发酵诱导时间(10 h)、接种量(3%,摇瓶)、装液量(30%)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加浓度(1 mmol/L),使OD_(600)增加了1.46倍,酶活提高了2.57倍。在此基础上,利用5 L发酵罐进行放大发酵实验,确定了最佳诱导时间。在最佳条件下,经过18 h的诱导发酵,菌体OD_(600)最高值达51.8,干重达到21.5 g/L,酶活达到103.8 U/mL。当细胞添加量为0.014 g DCW/L时,以500 g/L D-果糖为底物,pH为7,50℃,1 h转化率达28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可达149.74 g/L。该研究对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵生产具有参考价值。

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶法规标准及工艺研究进展

对国内外D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的法规标准情况进行研究比较,汇总了在北美、澳新、欧盟等地区行政许可的情况,阐述了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在我国的申报审批情况以及中国申报食品添加剂的流程办法,并梳理国内外工艺进展,为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的资源化利用和应用研究提供理论依据与参考,同时促进D-阿洛酮糖产业发展。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。

D-阿洛酮糖的生物转化及冷却结晶工艺优化

D-阿洛酮糖作为一种具有多重生理功能的食品添加剂,是近年来的研究热点。为完善D-阿洛酮糖上下游生产工艺,选取3种不同微生物来源的D-阿洛酮糖3-差相异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAEase)在大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行异源表达,通过对全细胞生物转化工艺的探索和不同重组菌催化能力的分析对比,发现重组表达了来源于多尔氏菌属(Dorea sp.CAG317)的DAEase的全细胞生物转化率达到32.60%。在此基础上对反应液进行色谱分离和纯化,得到高纯度的D-阿洛酮糖料液。对D-阿洛酮糖料液采取冷却结晶法析出晶体,结果显示采用优化后的冷却结晶工艺,D-阿洛酮糖结晶率达到了77.43%,纯度达到了98.70%。该研究为工业化生产D-阿洛酮糖提供重要参考。

miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌患者中的表达及临床意义

目的探讨miR-495-3p、miR-181d-5p在宫颈癌及宫颈癌前病变组织中的表达差异及对宫颈癌诊断的价值。方法收集2020年6月—2022年12月河北中石油中心医院收治的30例宫颈低级别鳞状上皮内病变(CINⅠ级组)、30例宫颈高级别鳞状上皮内瘤变(CINⅡ~Ⅲ级组)、50例宫颈癌(宫颈癌组)患者的临床资料及宫颈组织标本。采用免疫组化法检测各组宫颈组织中miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达情况,比较各组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率;采用RT-qPCR法检测宫颈癌组患者癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量,分析miR-495-3p和miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者临床病理特征的关系、miR-495-3p和miR-181d-5p对宫颈癌的诊断价值及二者在宫颈癌组织中表达的相关性。结果宫颈癌组miR-495-3p、miR-181d-5p阳性表达率均明显低于CINⅠ级组及CINⅡ~Ⅲ级组(P均<0.05)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与FIGO分期、肿瘤浸润深度、淋巴结转移有关(P均<0.05),FIGO分期越高、浸润越深二者表达量越低;miR-181d-5p表达量与分化程度有关(P<0.05),分化程度越高miR-181d-5p表达量越低。miR-495-3p、miR-181d-5p联合检测对宫颈癌的诊断价值高于miR-495-3p、miR-181d-5p单一检测(P=0.001)。宫颈癌组织中miR-495-3p、miR-181d-5p表达呈正相关。结论miR-495-3p、miR-181d-5p表达量与宫颈癌患者的FIGO分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关,两者表达之间具有一定相关性,二者联合检测有助于宫颈癌的诊断。

壳聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-果糖。实验结果表明:固定时间为3h,酶∶载体=15∶1(U/g),其酶活回收率达到45%。相比游离酶,固定化酶具有更高的温度稳定性以及在较宽的pH范围内保持较高酶活,其最适温度和pH分别为60℃与8.5。固定化酶在填充床中反应的最高转化率为24%,在最佳流速2.5mL/min下其转化率为19%,相关产率为6.7g/L·h,经过168h的反应,其转化率仍然保持在13%以上。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co^(2+)、Mn^(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。

工程大肠杆菌异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导工艺研究

以异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPEase)的工程大肠杆菌为出发菌株,在5L发酵罐培养的基础上,系统研究了大肠杆菌异源表达DPEase酶的诱导工艺。通过依次考察诱导时间点、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对工程大肠杆菌生长和DPEase酶活(单位时间内的转化率)的影响,综合考虑能耗和发酵周期,确定相应的最佳控制点,系统优化诱导条件。结果表明:指数生长期进行诱导,诱导前培养温度由37℃降至25℃、pH恒定7.0、IPTG诱导剂添加终浓度为0.5 mmol/L,可以理想平衡菌体生长和蛋白酶表达,反应30 min的DPEase酶平衡转化率达到28%左右,达到已公开报道的平均水平,为后续的生物转化工艺摸索提供原料供应。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55℃,Co^(2+)能够显著(P<0.05)增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/L IPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到(10.11±0.02)U/g,比优化前(1.38±0.01)U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为(11.47±0.04)g/L,比优化前(1.03±0.02)g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著(P<0.05)提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。

通过稳定剂提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的贮存稳定性

利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)对D-果糖的异构化反应是目前制备D-阿洛酮糖最经济环保的方式。但因DPE贮存稳定性较差,限制了其工业化应用。该文以Clostridium cellulolyticum DPE(CcDPE)为研究对象,寻找绿色高效、成本低廉且不影响后续酶反应的贮存稳定剂。考察了糖类、金属离子与多元醇类等稳定剂对CcDPE贮存效果和对后续酶反应的影响。先进行单因素实验,后对获得的2个最适的稳定剂进行复配。结果表明,甘油和Co^(2+)能显著提高CcDPE粗酶液的贮存稳定性,且不会对后续酶转化反应造成负面影响。在25℃下,1 mmol/L Co^(2+)可以将粗酶液半衰期从4.5 d延长到46 d;30%(体积分数)甘油可以将半衰期延长到33 d;20%(体积分数)甘油与0.5 mmol/L Co^(2+)的复配组合可以将半衰期延长至80 d。研究结果为CcDPE的进一步工业化应用提供了技术支撑。

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。

D-阿洛糖下调半乳糖凝集素-3抑制AMPK/mTOR通路减轻脑缺血再灌注损伤

目的探讨D-阿洛糖(D-allose)对小鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)的神经功能恢复、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、腺苷一磷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/mTOR)及部分炎症因子表达的影响。方法C57BL/6雄性小鼠50只,随机分为对照组(Con组)、假手术组(Sham组)、脑缺血再灌注损伤组(MCAO组)、脑缺血再灌注损伤+D-阿洛糖组(MCAO+D-allose组)及脑缺血再灌注损伤+改良柑橘果胶组(MCAO+MCP组)。采用线栓法建立大脑中动脉闭塞/再灌注(MCAO/R)模型。造模成功后对小鼠进行Longa神经功能评分及转棒行走评分;采用TTC染色法观察脑梗死灶体积;通过Western blot及RT-PCR技术检测Gal-3、自噬相关分子的表达水平;免疫荧光技术检测脑组织中Gal-3的分布情况;试剂盒检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-8分泌。结果相较于Con组和Sham组,MCAO模型可增加小鼠神经功能评分(P<0.01)、增加脑梗死体积(P<0.01)、上调Gal-3的表达并增强自噬(P<0.01)。给予D-阿洛糖及Gal-3抑制剂MCP治疗后可改善神经功能障碍、减小脑梗死体积(P<0.01),并降低Gal-3的表达(P<0.01),抑制AMPK磷酸化,促进mTOR磷酸化,抑制自噬(P<0.01)。结论D-阿洛糖可有效促进CIRI小鼠神经功能恢复和减小梗死灶体积,其机制可能是通过下调Gal-3的表达进而抑制组织损伤后细胞过度自噬,并减少TNF-α,IL-8等炎性因子释放,从而发挥神经保护作用。

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。

各种化学条件对Merdimonas faecis BR31T D-阿洛酮糖3-差向异构酶的影响

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能够催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的酶,在不同化学条件下D-阿洛酮糖会表现出不同的活性:温度过高过低都会影响其活性,经研究得到在60℃该酶表现出最优活性;过酸过碱的条件也不利于酶活性的表达,只有在中性环境下能表现出最优活性;而不同二价金属离子存在时,也会不同程度的抑制或者增加酶的活性,当加入Co2+时得到最优活性。

高效液相色谱测定D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力

D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以将D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖。为建立D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力测定方法,首先建立了高效液相色谱法测定产物D-阿洛酮糖含量的方法,进而测得D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力。采用50 mg/L EDTA钙溶液作为流动相等度洗脱Waters Sugar-Pak I色谱柱(柱温90℃,流速0.3 m L/min,进样量10μL),采用示差检测器测定D-阿洛酮糖含量。结果表明,该方法测定酶反应产物D-阿洛酮糖含量得检测限为4.12 mg/L,定量限为10.3 mg/L,在0.5~5.0 g/L范围内线性度良好,R~2=1,重复性(RSD)小于1.0%,加标收回率为98.92%。在此基础上进一步确定D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力测定时的酶反应最适温度45℃,最适pH值7.0,D-果糖底物质量分数24%,反应时间20 min。经检验,该酶活力检测方法的精密度RSD小于5.0%,达到酶活力检测要求。

结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶抑制剂的3D-QSAR研究及优化设计

结核分枝杆菌是导致结核病的病原体,1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶是结核分枝杆菌代谢的关键限速酶,因此被作为一个有潜力的抗菌靶点。收集了35个对结核分枝杆菌1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(mtDXR)有体外抑制活性的膦胺霉素衍生物,运用比较分子场分析方法和比较分子相似性指数分析方法对它们进行三维定量构效关系研究,建立了相应模型。结果表明:CoMFA模型的最佳主成分值n=7,交互检验系数q^(2)=0.601,相关系数r^(2)=0.979;CoMSIA模型的最佳主成分值n=8,交互检验系数q^(2)=0.609,相关系数r^(2)=0.983。数据显示所建模型拥有较为可靠的预测能力。同时,利用分子对接进一步考察膦胺霉素类小分子抑制剂和靶点活性部位氨基酸残基的非键作用,结合3D-QSAR等势图,明确了该类化合物分子结构上可供加工和优化的区域,进而设计出14个全新的膦胺霉素衍生物,并对它们进行活性预测,得到了拥有更高预测活性的新化合物27m,为mtDXR抑制剂的进一步开发提供了理论依据和重要参考。

miR-519d-3p靶向HIF-1α抑制高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能障碍及血管生成

目的:明确miR-519d-3p对高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能障碍与血管生成的影响,并阐明其对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的调控机制。方法:通过5、30mmol/L葡萄糖分别诱导HRMEC建立正常(NG)和高糖(HG)细胞模型。将HRMEC分为对照组(HG细胞模型转染阴性对照模拟物)、甘露醇组(对照组加入25mmol/L甘露醇)、miR-519d-3p过表达组(HG细胞模型转染miR-519d-3p模拟物)、miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组(HG细胞模型共转染miR-519d-3p模拟物和HIF-1α过表达载体)。实时荧光定量PCR法检测各组miR-519d-3p的表达情况。Western blotting法检测各组HIF-1α蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验检测miR-519d-3p和HIF-1α的结合位点情况。CCK-8法检测各组细胞增殖情况。Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡情况。ELISA法检测各组细胞外液炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6蛋白的表达情况。小管形成实验检测各组新生毛细血管管腔样结构形成情况。结果:与NG相比,HG细胞模型中miR-519d-3p表达显著减少,而HIF-1α蛋白表达显著增加(均P<0.01)。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组中HIF-1α蛋白表达显著降低(P<0.01)。miR-519d-3p中“CGUGAAA”序列可以与HIF-1α3'-非编码区(3'-UTR)中“GCACUUU”序列特异性结合。与对照组比较,miR-519d-3p过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著增加,细胞凋亡率显著减少,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著减少,新生毛细血管管腔样结构数量显著减少(均P<0.01)。与miR-519d-3p过表达组比较,miR-519d-3p联合HIF-1α过表达组细胞24、48、72h吸光度值均显著减少,细胞凋亡率显著增加,细胞外液TNF-α、IL-1β、IL-6浓度均显著增加,新生毛细血管管腔样结构数量显著增加(均P<0.01)。对照组和甘露醇组中上述各指标比较无差异(均P>0.05)。结论:高糖诱导HRMEC模型中miR-519d-3p表达下调,而HIF-1α蛋白表达上调。HIF-1α是miR-519d-3p的靶基因,miR-519d-3p靶向HIF-1α增加细胞增殖并降低细胞凋亡和炎症反应,从而减轻高糖诱导的HRMEC功能障碍并抑制血管生成。

D-阿洛酮糖的专利技术综述

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,是自然界中存在量极少的稀有糖,其具有调节血糖、减少能量摄入等生理功能,广泛应用于食品、医药、化妆品、高分子等领域,近年来成为甜味剂的研究热点之一。文章主要综述了D-阿洛酮糖的全球、国内专利申请情况、专利技术发展情况以及重点申请人分析,以期为国内研发机构和相关企业在D-阿洛酮糖领域的创新研发方向、专利保护策略以及知识产权布局提供有益的参考和建议。