祖先序列重建增强D-阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性

为解决现有D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)热稳定性差的产业问题,本文采用系统发育指导的大数据挖掘、合理修饰和祖先序列重建策略(ASR),重建了具有不同催化结构域DAEase的祖先序列,构建了表达载体,通过重组表达与分子对接筛选出了DAEase A13并进行酶学性质表征,此外,还基于结构分析与分子动力学模拟揭示了DAEase A13热稳定性增强的分子机制。结果表明,基于ASR策略所构建的A13 70℃时半衰期可达8.4 h,其热稳定性较野生(WT)酶显著增强,最大转化率为31%,催化活性也略高于WT酶。立体结构模拟与分子动力学模拟揭示了ASR A13中大量氢键和疏水作用的增加维持了高温下酶分子结构的稳定性,是其热稳定性增强的主要因素。研究结果证实了ASR策略可以改造DAEase使其稳定性、活性和混杂性增强,可以为D-阿洛酮糖工业生产提供良好的生物催化剂。

重组大肠杆菌发酵条件优化提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的研究

功能性稀有糖D-阿洛酮糖主要由基因工程菌株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase,DAE)催化果糖生产。该研究以表达DAE的重组大肠杆菌为研究对象,利用单因素试验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子等成分进行优化,获得了最佳的培养基组合:蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨15 g/L、(NH4)2SO_(4)3 g/L、KH2PO_(4)3 g/L、MgSO_(4)0.5 g/L、MnSO_(4)0.025 mmol/L。在此基础上,利用单因素试验对培养条件进行研究,确定了最佳发酵诱导时间(10 h)、接种量(3%,摇瓶)、装液量(30%)以及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)添加浓度(1 mmol/L),使OD_(600)增加了1.46倍,酶活提高了2.57倍。在此基础上,利用5 L发酵罐进行放大发酵实验,确定了最佳诱导时间。在最佳条件下,经过18 h的诱导发酵,菌体OD_(600)最高值达51.8,干重达到21.5 g/L,酶活达到103.8 U/mL。当细胞添加量为0.014 g DCW/L时,以500 g/L D-果糖为底物,pH为7,50℃,1 h转化率达28.76%,D-阿洛酮糖最高生成量可达149.74 g/L。该研究对D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵生产具有参考价值。

高稳定液态D-阿洛酮糖3-差向异构酶制剂研究

为解决D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAE)衰减过快、贮运成本高的问题,拟开发一款具有良好存贮稳定性的DEA液态酶制剂。以半衰期为评价依据,通过单因素试验筛选出对半衰期影响显著的4个因素,并进一步利用响应曲面法对酶制剂的配方进行优化。结果表明:稳定DAE酶制剂的最佳配比为0.1mol·L^(-1)CaCl_(2)、3.96%海藻糖、41.68%葡萄糖、29.32%PEG-400。在此条件下,半衰期为292天,与模拟理论值的相对误差仅为0.17%。通过工艺优化,将DAE的储存时间大幅延长,提高了酶制剂的贮运性能。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。

壳聚糖固定D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖的异构酶。本实验采用壳聚糖作为载体制备固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,考察了固定化酶的制备条件和酶学性质,并研究在填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶持续转化D-果糖。实验结果表明:固定时间为3h,酶∶载体=15∶1(U/g),其酶活回收率达到45%。相比游离酶,固定化酶具有更高的温度稳定性以及在较宽的pH范围内保持较高酶活,其最适温度和pH分别为60℃与8.5。固定化酶在填充床中反应的最高转化率为24%,在最佳流速2.5mL/min下其转化率为19%,相关产率为6.7g/L·h,经过168h的反应,其转化率仍然保持在13%以上。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶的异源表达和酶学性质

克隆了来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因,利用重叠延伸PCR技术在Cb-dpe基因的上游加入了P43启动子,形成P43-Cb-dpe,再将P43-Cb-dpe连接到p MA5载体上构建出双启动子表达载体,并导入到Bacillus subtilis WB800中进行表达;与单启动子表达系统相比,双启动子表达载体能够显著提高Cb-dpe的表达量。对重组Cb-DPE酶进行了分离纯化和酶学性质的研究,结果表明:重组Cb-DPE的最适温度为55℃,最适pH为7.0,在温度30~40℃范围内和pH 6.5~7.5之间有良好的稳定性;Co^(2+)、Mn^(2+)可显著增强酶活;D-阿洛酮糖为底物时,K_m为26.68 mmol/L,小于果糖的61.80 mmol/L,说明该酶对D-阿洛酮糖的亲和性比对D-果糖的高。而在动力学参数方面,以D-阿洛酮糖为底物对应的催化效率K_(cat)/K_m为95.8 L/(mmol·min),大于以果糖作为底物时的54.1 L/(mmol·min)。

枯草芽孢杆菌产D-阿洛酮糖3-差向异构酶的发酵优化

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3位的差向异构体,由于较低的热量和与蔗糖相似的甜度,D-阿洛酮糖成为一个具有发展前景的功能性甜味剂。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,EC 5.1.3.30,DPEase)能够催化D-果糖生产D-阿洛酮糖,这种生物酶法制备的功能性甜味剂D-阿洛酮糖由于简单的纯化步骤和高产物浓度等优点受到关注。该研究对1株前期构建的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 1A751/pUB-P43dpe-dal产DPEase进行了3 L发酵罐水平培养,通过优化溶解氧(DO)、pH、温度、初始碳源质量浓度确定最适发酵条件为:DO为30%、pH 6.0、温度37℃、初始葡萄糖质量浓度15 g/L,最高发酵酶活达78.3 U/mL。在此基础上进行补料发酵优化,得到最适补料条件为:在发酵5 h进行补料,碳源补料速率8.0 g/(L·h),在此条件下,发酵9 h全细胞酶活高达123.0 U/mL。此发酵策略为扩大工业化生产提供了参考。

工程大肠杆菌异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导工艺研究

以异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,缩写为DPEase)的工程大肠杆菌为出发菌株,在5L发酵罐培养的基础上,系统研究了大肠杆菌异源表达DPEase酶的诱导工艺。通过依次考察诱导时间点、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对工程大肠杆菌生长和DPEase酶活(单位时间内的转化率)的影响,综合考虑能耗和发酵周期,确定相应的最佳控制点,系统优化诱导条件。结果表明:指数生长期进行诱导,诱导前培养温度由37℃降至25℃、pH恒定7.0、IPTG诱导剂添加终浓度为0.5 mmol/L,可以理想平衡菌体生长和蛋白酶表达,反应30 min的DPEase酶平衡转化率达到28%左右,达到已公开报道的平均水平,为后续的生物转化工艺摸索提供原料供应。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在大肠杆菌内的高效可溶性表达及发酵条件研究

将来源于Clostridium bolteae ATCCBAA-613的DAEase基因序列经密码子优化合成,以pCold TF为表达载体,冷休克启动子CspA低温诱导DAEase基因在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,得到高效可溶性的重组Cb-DAEase并利用镍柱亲和层析分离纯化。结果表明,Cb-DAEase最适pH和温度为7.0和55℃,Co^(2+)能够显著(P<0.05)增强酶活力。对培养条件进行优化得到,在7 g/L甘油、10 g/L酵母膏、1%接种量、0.25 mmol/L IPTG、诱导前培养5 h的条件下,Cb-DAEase活力达到(10.11±0.02)U/g,比优化前(1.38±0.01)U/g提高了7.33倍;以120 g/L的D-果糖为底物全细胞催化0.5 h后,D-阿洛酮糖产量为(11.47±0.04)g/L,比优化前(1.03±0.02)g/L提高了11.14倍。基于冷休克表达策略构建的重组菌经发酵优化后Cb-DAEase活力显著(P<0.05)提高,为高效制备D-阿洛酮糖提供了理论支持。

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_(hag)介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P_(43)介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_(hag)的核糖体结合位点(ribosome binding site,RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。

通过稳定剂提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶的贮存稳定性

利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)对D-果糖的异构化反应是目前制备D-阿洛酮糖最经济环保的方式。但因DPE贮存稳定性较差,限制了其工业化应用。该文以Clostridium cellulolyticum DPE(CcDPE)为研究对象,寻找绿色高效、成本低廉且不影响后续酶反应的贮存稳定剂。考察了糖类、金属离子与多元醇类等稳定剂对CcDPE贮存效果和对后续酶反应的影响。先进行单因素实验,后对获得的2个最适的稳定剂进行复配。结果表明,甘油和Co^(2+)能显著提高CcDPE粗酶液的贮存稳定性,且不会对后续酶转化反应造成负面影响。在25℃下,1 mmol/L Co^(2+)可以将粗酶液半衰期从4.5 d延长到46 d;30%(体积分数)甘油可以将半衰期延长到33 d;20%(体积分数)甘油与0.5 mmol/L Co^(2+)的复配组合可以将半衰期延长至80 d。研究结果为CcDPE的进一步工业化应用提供了技术支撑。

根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶能够催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖。为实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的异源表达,设计引物,克隆并分离其序列,通过生物信息学软件分析D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DNA和蛋白质的结构特点。结果表明,该基因开放阅读框870bp,编码289个氨基酸;蛋白质二级结构中α-螺旋占38.41%,β-折叠占47.06%,无规则卷曲占14.53%;该蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,定位于细胞膜;构建原核表达载体并导入E.coliBL21宿主中,表达的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶分子质量约为33kDa,1mmol/LIPTG诱导E.coliBL21重组菌28h后,目的蛋白表达量和酶活分别为0.32g/L和3.8U/mL。根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因能够在大肠杆菌中实现表达。

各种化学条件对Merdimonas faecis BR31T D-阿洛酮糖3-差向异构酶的影响

D-阿洛酮糖3-差向异构酶是一种能够催化D-果糖生成D-阿洛酮糖的酶,在不同化学条件下D-阿洛酮糖会表现出不同的活性:温度过高过低都会影响其活性,经研究得到在60℃该酶表现出最优活性;过酸过碱的条件也不利于酶活性的表达,只有在中性环境下能表现出最优活性;而不同二价金属离子存在时,也会不同程度的抑制或者增加酶的活性,当加入Co2+时得到最优活性。

D-阿洛酮糖-3-差向异构酶法规标准及工艺研究进展

对国内外D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的法规标准情况进行研究比较,汇总了在北美、澳新、欧盟等地区行政许可的情况,阐述了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在我国的申报审批情况以及中国申报食品添加剂的流程办法,并梳理国内外工艺进展,为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的资源化利用和应用研究提供理论依据与参考,同时促进D-阿洛酮糖产业发展。

高效液相色谱测定D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力

D-阿洛酮糖3-差向异构酶可以将D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖。为建立D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力测定方法,首先建立了高效液相色谱法测定产物D-阿洛酮糖含量的方法,进而测得D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力。采用50 mg/L EDTA钙溶液作为流动相等度洗脱Waters Sugar-Pak I色谱柱(柱温90℃,流速0.3 m L/min,进样量10μL),采用示差检测器测定D-阿洛酮糖含量。结果表明,该方法测定酶反应产物D-阿洛酮糖含量得检测限为4.12 mg/L,定量限为10.3 mg/L,在0.5~5.0 g/L范围内线性度良好,R~2=1,重复性(RSD)小于1.0%,加标收回率为98.92%。在此基础上进一步确定D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活力测定时的酶反应最适温度45℃,最适pH值7.0,D-果糖底物质量分数24%,反应时间20 min。经检验,该酶活力检测方法的精密度RSD小于5.0%,达到酶活力检测要求。

Clostridium cellulolyticum D-塔格糖3-差向异构酶基因的克隆、表达及酶活性

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。作者克隆到一种新型的D-塔格糖3-差向异构酶基因,来源于微生物Clostridium cellulolyticumH10。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白质的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约31 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明:该重组酶具有较高的转化活性。

D-塔格糖3-差向异构酶家族蛋白的研究进展

稀有糖是在自然界中存在但含量极少的一类单糖及衍生物,其在膳食、保健、医药等领域中发挥着重要的功能。D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,缩写为DTE)家族蛋白在稀有糖生物转化中占有重要地位。文中对DTE家族蛋白的最新进展进行了综述;同时,展望了DTE家族蛋白的研究趋势。

Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向异构酶的诱导表达、纯化及活性研究

D-塔格糖3-差向异构酶是生物法生产新型功能性因子D-阿洛酮糖最为有效的酶。一种新型的能够编码D-塔格糖3-差向异构酶的基因CLOBOL_00069被克隆,它来源于Clostridium bolteae ATCC BAA-613。以pUC57为克隆载体,以pET-22b(+)为载体质粒,E.coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组工程菌。IPTG诱导剂诱导目的蛋白的表达;通过镍柱亲和层析,杂蛋白与目的蛋白得到了很好的分离。对纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约32ku处出现明显的特征条带。通过活性研究表明,Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DTEase属于DTEase家族,并具有较高的生物转化率,反应10h后转化率达到20%。

重组地衣芽孢杆菌全细胞转化法制备D-阿洛酮糖

该研究首次在地衣芽孢杆菌中异源表达溶纤瘤胃杆菌H10来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase, DPE),开拓D-阿洛酮糖生物合成法又一新的表达载体途径。首先,选取不同启动子介导表达该酶,选取表达效果最好的重组菌BL1进行全细胞转化条件和发酵条件的优化。利用优化后的重组菌全细胞转化条件,65℃、反应体系细胞OD_(600)值为2、反应10 min、底物D-果糖100 g/L探索出发酵培养条件,碳源为蔗糖75 g/L、初始pH 7.5、37℃,最终利用全细胞转化方法,65℃、500 g/L D-果糖、反应体系细胞OD_(600)值为30、反应20 min,转化率达30.3%,D-阿洛酮糖产量可达120 g/L,单位酶活力达到33.3 U/mL。采用分4次添加与果糖摩尔质量比为0.4的硼酸至反应体系中的方法,将转化率提高至69.8%。该研究为工业生产D-阿洛酮糖提供一定的参考价值。

Clostridium scindens ATCC35704中的D-塔格糖-3-差向异构酶的克隆表达、纯化及活性研究

D-阿洛酮糖作为一种新型低热量功能性甜味剂,可以通过D-塔格糖-3-差向异构酶家族,以D-果糖为底物C-3位异构化得到。一个新的来源于微生物Clostridium scindens ATCC 35704中ZP 0243228的D-塔格糖-3-差向异构酶基因(CS-DTE),通过克隆并成功导入E.coli BL21(DE3)中,构建了基因重组菌,诱导目的重组基因过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE分析,在约31 ku处出现显著的特征蛋白条带;通过对其活性检测表明,该重组酶分别以D-塔格糖和D-果糖为底物,可以生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖,转化率分别为8.6%和27.9%。