采用大孔吸附树脂纯化发酵液中D-3-苯基乳酸

为从发酵液中分离纯化D-3-苯基乳酸(D-3-phenyl lactic acid,PLA),利用重组大肠杆菌E.coli p ET-28aldhY52V转化底物苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)合成PLA,采用离子交换法对PLA纯化工艺进行了初步研究。通过对6种常用阴离子交换树脂对PLA的静态吸附容量测定,确定了D315具有较强的PLA吸附性能。在固定床上样条件优化结果表明,上样流速为4 BV/h、径高比为1∶7时,上样吸附效果较好。利用二阶段洗脱工艺:第一阶段用100 mmol/L HCl进行洗脱,第二阶段用200 mmol/L Na Cl在5 BV/h流速下洗脱。洗脱验证结果表明,第一阶段洗脱液中PLA/PPA的质量浓度比值由初始的4.2上升到10.3,PLA收率为66.4%。研究结果为进一步采用离子交换法纯化发酵液中PLA的工艺优化提供了借鉴。

重组融合蛋白大肠杆菌不对称合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸

将来自于Lactobacillus plantarum的突变D-乳酸脱氢酶(D-LDH^(Y52V))和Candida boidinii的甲酸脱氢酶(FDH)进行融合,重组成双功能融合蛋白,为生物法合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重叠延伸PCR技术,将对底物苯丙酮酸(PPA)亲合力更高的突变蛋白D-LDH^(Y52V)与FDH通过连接肽(Gly4Ser)3融合,将融合基因克隆至表达载体p ET-28a(+),并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,融合蛋白分子质量为79.7 k Da,在重组菌中获得了正确表达;酶活性测定结果表明,融合蛋白具有D-LDH和FDH的双重生物学活性。在不对称转化PPA合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(DPLA)的应用中,融合蛋白体系比D-LDH^(Y52V)单独表达体系的D-PLA产量提高了40.71%。通过5 h底物分批补加发酵,D-PLA产量为17.34 g/L,底物转化率为77.64%,生产强度3.47 g/(L·h)。双功能融合蛋白增强了辅酶再生的效率,有效促进了(R)-2-羟基-3-苯基丙酸的不对称合成。