D-荧光素的结构和振动光谱的理论研究

采用密度泛函的B3LYP和B3PW91方法在6-311++G**基组水平上全优化了D-荧光素分子的平衡构型和振动光谱。采用标度量子力学力场(SQM)方法研究了D-荧光素分子的振动光谱。为了详细分析振动模式的贡献,定义了分子的局域内坐标,用改编的分子振动计算程序组将计算的笛卡尔坐标力常数转换成了局域内坐标力常数。用GF矩阵方法进行了简正坐标分析,获得了振动频率和势能分布(PEDs)。根据PEDs对所有的振动模式进行了指认。结果表明,在红外光谱中,所有振动模式均有红外活性,其中吸收强度最强的峰的振动频率为1 780cm-1,吸收强度为507KM·mol-1,根据计算所得的PEDs矩阵,可以清楚的看出该振动吸收峰主要由羧基C21O22双键伸缩振动所贡献,其PEDs为93%。在拉曼光谱中,D-荧光素分子的所有振动模式也表现出了拉曼活性,振动频率在1 200~1 700cm-1范围的吸收峰具有较强的拉曼活性。其中吸收强度最强的吸收峰的频率为1 573cm-1,吸收强度为297KM·mol-1,是五元环CN键的伸缩振动所贡献。结果可为进一步研究荧光素衍生物的结构、发光活性提供一定的理论依据。

调血脂类中药及中药单体对羧酸酯酶1体外活性抑制作用研究

目的:采用羧酸酯酶1(hCE1)特异性化学发光探针D-荧光素甲基醚(DME),在人肝微粒体(HLM)体系中测定18种调血脂类中药及12种中药单体对hCE1活性的抑制作用。方法:在HLM体系中,取不同中药饮片70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取层(简称酯层)与残留水层及中药单体化合物,分别与hCE1特异性探针DME在37℃条件下共同孵育,通过测定探针底物代谢产物的相对光单位(RLU)值计算酶活力(Eres),判断提取物及中药单体对hCE1的抑制程度。结果:绿茶酯层、女贞子水层、干姜酯层、甘草次酸、胡椒水层、决明子水层、红花酯层、决明子酯层、柴胡水层、制何首乌水层、胡椒酯层、蒲黄酯层对hCE1有较强的抑制作用(Eres<20%),质量浓度为20μg·mL–1时hCE1酶活力分别为0.35%、0.89%、3.69%、5.26%、5.64%、6.34%、7.79%、12.04%、13.70%、15.35%、16.66%、18.89%。结论:绿茶、女贞子、干姜、甘草、胡椒、决明子、红花、柴胡、制何首乌、蒲黄中的化学成分对hCE1有较强的抑制作用。服用这些药物或食物,如饮茶时,需要注意其羧酸酯酶抑制作用会影响hCE1参与代谢的药物的血药浓度及药效。

液相色谱质谱法测定萤火虫荧光素

[目的]建立快速测定D-虫荧光素的液相色谱-质谱(HPLC-MS/MS)分析方法,并对荧光素的碎裂机理进行解析。[方法]采用Shim-pack VP-ODS(150 L×2.0 mm,5 μm)色谱柱,甲醇、水梯度洗脱12 min进行色谱分离;在质谱正离子模式下,用6对反应监测离子对(MRM)进行定性、定量分析。[结果]目标化合物在0.625~125.000 μg/L线性关系良好( r =0.996 9),检出限为0.250 μg/L( S/N 为5)。[结论]该方法灵敏度高、选择性好,不仅可用于萤火虫发光机理、发光强弱差异、发光颜色差异方面的研究,还可以用于其他需要定量测定荧光素的研究。

薏苡仁脂干预MCF-7/DOX细胞中荧光药物动力学及部分耐药蛋白表达

本文从薏苡仁脂干预耐药乳腺癌细胞的荧光药物动力学以及对耐药基因和蛋白表达量的影响两方面着手,研究薏苡仁脂逆转乳腺癌细胞耐药的机制。首先通过建立稳定过表达荧光素酶的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/DOX^(Fluc),应用生物发光成像技术(bioluminescence imaging,BLI),实时监测细胞内ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白底物D-荧光素钾的外排动力学过程,检测薏苡仁脂干预前后D-荧光素钾的胞内动力学变化。结果表明,与空白组相比,薏苡仁脂明显减少MCF-7/DOX^(Fluc)对D-荧光素钾的外排,增加胞内累积量。此外,采用实时定量基因扩增荧光检测系统和蛋白免疫印迹技术,研究薏苡仁脂干预后MCF-7/DOX^(Fluc)中ABC转运子的基因及蛋白表达的变化。结果显示,薏苡仁脂处理后可下调MCF-7/DOX^(Fluc)细胞中P-糖蛋白(P-gp/ABCB1)、多药耐药相关蛋白1(MRP1/ABCC1)以及乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)等耐药基因和蛋白的表达。最后将薏苡仁脂联合多柔比星对薏苡仁脂逆转乳腺癌耐药效果进行体外评价,结果证明薏苡仁脂可增强多柔比星抑制MCF-7/DOX细胞增殖的作用,其最佳联合比例为薏苡仁脂︰多柔比星=25︰1。薏苡仁脂可以通过抑制ABC转运蛋白的外排功能和下调ABC转运蛋白在肿瘤细胞表达水平,双管齐下逆转化疗药物多柔比星的肿瘤多药耐药。

新型过氧化氢生物发光探针的合成与光学性质评价

目的设计并合成一个用于过氧化氢(H_(2)O_(2))可视化检测的新型小分子生物发光探针(HPBP)。方法在萤火虫萤光素的6’位羟基引入特异性识别基团芳基硼酸酯,构建H_(2)O_(2)小分子探针HPBP。通过探针与底物反应后光学信号强度的变化,对H_(2)O_(2)检测的特异性和灵敏度进行考察。结果成功制备了HPBP,该探针对低浓度H_(2)O_(2)(0.25~5μmol·L^(-1))的响应具有良好的浓度依赖性,且在H_(2)O_(2)浓度低于其他物质20~300倍时,发光强度仍为其他物质的2~5倍。结论制备的HPBP探针检测限低,特异性强,为研究H_(2)O_(2)在疾病发生发展过程中的机制和作用提供了有力工具。

基于luciferin-luciferase体系的肼生物发光探针的设计、合成与光学评价

目的设计并合成一个用于肼(N_2H_4)可视化分析检测的小分子生物发光探针(bioluminescence probe for hydrazine,BLHy),并评价其光学响应性能。方法在光学报告的基团羟基萤光素(D-luciferin)上适当修饰位点,通过合理设计,引入肼的特异性识别基团(4-溴丁酸酯),设计和构建一个小分子生物发光探针BLHy。通过探针与底物反应后的信号强度和光学波长的变化,研究探针在肼可视化检测和分析中的应用。结果成功设计并合成了一个小分子生物发光探针BLHy。该探针在Tris-HCl缓冲体系中能特异性对肼进行响应,强度是其他物质的4~17倍,表现出良好的选择性;探针对0~333μmol·L^-1肼的响应具有良好的浓度依赖性(r^2=0. 9987)。结论首次以luciferin-luciferase生物发光体系作为分析技术,设计并合成了用于肼检测的生物发光探针BLHy,为进一步研究肼在复杂自然环境和生物体系中的作用和机制提供了有力的工具。

基于luciferin-luciferase体系的肼生物发光探针的合成、体外评价及活体成像

本文设计合成了一个用于可视化分析检测肼(N_2H_4)的生物发光探针(bioluminescent probe for hydrazine,BPH),并完成对其光学响应性能和活体成像的评价。本文所描述的肼生物发光探针(BPH)是通过在光学报告基团萤火虫荧光素(firefly luciferin)的适当修饰位点合理设计引入肼的特异性识别基团(乙酰基)以达到检测肼的目的,并且该探针以高选择性和高灵敏度等显著优点成功应用于活体水平对肼的可视化分析。实验结果表明,无论是在复杂的自然环境中还是在动物体内,本研究所发展的生物发光探针BPH是一种具有高创新性和广泛应用价值的检测肼的方法。