罗氏沼虾三群体线粒体D-loop基因序列差异的初步研究

通过测定罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)人工养殖群体(A)(浙江湖州)、缅甸引进群体F2代(B)和"南太湖1号"(C)3个群体线粒体控制区(D-loop)基因序列片段(约1200bp),探讨罗氏沼虾群体遗传结构。结果发现,在用于分析的1121 bp基因序列中有86个变异位点,共计14个单倍型。其中,群体A、C的遗传多样性均较低,其π值分别为0.022和0.025,相比之下,群体B的遗传多样性则明显要高于上述两个群体(π=0.032)。AMOVA分析表明,群体间的遗传变异占总遗传变异的6.32%,而93.68%的遗传变异源于群体内。对三群体的遗传学参数计算结果表明,群体A和B间遗传分化指数(Fst)为0.105,已达到中等分化水平;群体C与A间的遗传距离(D=0.025)最小,提示它们的亲缘关系最近。本研究结果认为,D-loop基因可以作为检测罗氏沼虾群体遗传差异的分子标记,"南太湖1号"群体遗传多样性比人工养殖群体有所提高,但仍偏向养殖群体,未表现出最高的杂种优势。

额尔齐斯河2种类型雌性银鲫的形态特征及D-loop基因序列比较

2008年5月调查发现,在额尔齐斯河主河道（185团）的雌性银鲫（Carassius auratus gibelio）群体中存在2种形态类型,按照体长比体高的形态学性状区分,分别为高背型（1.78~2.14）和低背型（2.18~2.39）。形态学分析表明,高背型和低背型的侧线鳞分别为31和30,侧线上（下）鳞为分别7和6,两者在体高、头高、尾柄高、体宽、头宽等性状上存在显著差异（P＆lt;0.01）,高背型比低背型具有明显的体型优势。生长特性分析表明,在相同体长或年龄的雌性群体中,高背型的平均体质量约为低背型的1.3~1.9倍,而表现出更为优越的生长性能。线粒体控制区序列分析表明,高背型和低背型群体各自独享1个单倍型（分别为EG1和ED1）,为2个不同的遗传谱系类群,遗传分化仅为0.004,远低于属内种间的0.020~0.045,两者尚属群体内变异;在分子系统关系中,高背型和低背型分别与方正银鲫的2个单倍型（FZ1和FZ13）共享并聚为单系,推测额尔齐斯河银鲫源自于黑龙江（方正银鲫）。与国内其他地方群体或品种比较表明,额尔齐斯河2种类型雌性银鲫,特别是高背型具有更为突出的生长优势,可作为优良的开发养殖品种和更具潜力的鱼类育种材料。

浙江新昌光唇鱼(Acrossocheilus)CO Ⅱ和D-loop基因克隆及系统发育分析

采用扩增COⅡ、D-loop序列、进行序列比对和系统树分析并结合形态特征观察的方法,研究了浙江新昌光唇鱼(Acrossocheilus)的系统分类和种类鉴定。形态特征结果表明,新昌光唇鱼具有光唇鱼属鱼类的基本特征;扩增得到COⅡ序列全长691bp,D-loop序列全长931—944bp,A+T含量两基因序列都高于G+C(A+T的含量分别为57.30%—57.80%和65.30%—65.90%),G的含量在四种碱基中最低;COⅡ序列有6个碱基位点存在转换,而D-loop则存在多个碱基的转换、颠换、缺失或插入位点。浙江新昌光唇鱼群体内COⅡ、D-loop基因的平均遗传距离分别为0.003、0.005;基于COⅡ和D-loop序列构建的NJ法系统树均显示新昌光唇鱼与温州光唇鱼(A.wenchowensis)形成一个紧密的簇,序列相似性分别为99.94%和99.36%,遗传距离分别为0.000、0.011,未达到种间分化水平(遗传距离大于0.05),表明新昌光唇鱼与温州光唇鱼为同一种,且根据形态特征可以断定为二个不同的地理群体,而D-loop序列因进化速度较快更适于光唇鱼属种内及近缘物种的种间亲缘关系的研究。研究结果既有助于新昌光唇鱼资源的开发利用,又可为研究光唇鱼类的分类提供参考资料。

中国地鼠线粒体D-loop基因的克隆及序列分析

本试验根据已知相近物种动物基因序列设计引物,PCR扩增获得中国地鼠线粒体D-loop基因序列。采用DNAS-tar软件计算序列碱基组成,分析遗传变异情况。用MEGA 4.1软件计算物种间遗传距离,采用邻接法(NJ)、最小进化法(ME)构建系统进化树。结果表明,中国地鼠线粒体D-loop区序列全长为867bp,碱基A、T、C、G的含量分别为29.53%、31.49%、26.07%、12.92%,中国地鼠与啮齿类动物有相似的碱基组成。系统进化树结果显示,中国地鼠与金黄地鼠亲缘关系较近,与大鼠的关系最远,与传统的分类相一致。所获得的中国地鼠D-loop基因可作为种间遗传变异研究的标记,研究结果为进一步研究中国地鼠的群体遗传结构奠定了基础。

河北3个日本沼虾野生群体线粒体DNA D-Loop基因序列变异及种群遗传结构分析

为进一步了解白洋淀与衡水湖日本沼虾种质资源现状,实验通过对白洋淀南淀(SB)、白洋淀北淀(NB)、衡水湖(HS)日本沼虾群体线粒体DNA D-Loop基因片段进行扩增和测定,得到935 bp的序列用于进一步的分析,其中变异位点80个,占分析位点的8.56%,含有77个简约信息位点,平均转颠换比值(TS/TV)为7.28,4种碱基在所得序列中平均含量为A(42.65%)、G(9.08%)、T(36.98%)、C(11.29%),其中A+T含量为79.63%,明显高于C+G含量。AMOVA分析结果显示,群体间的遗传分化系数FST=0.2336,群体间遗传变异占23.36%,群体内遗传变异占76.64%,群体间具有较高程度的遗传分化。运用K-2-P模型构建了3群体的23个单倍型的NJ系统发育树,单倍型之间并没有按照单倍型所属群体的分类聚簇,表现为不同群体个体相互交错形成复杂的簇群。群体中性检验、错配分析表明,日本沼虾近期未曾经历过种群扩张。

线粒体DNA D-loop基因多态性与肾透明细胞癌发病的相关性分析

目的探讨线粒体DNA(mtDNA)D-loop基因多态性与肾透明细胞癌的关系。方法选取2014年3月~2017年2月在我院治疗的肾透明细胞癌患者63例为观察组,同时选取健康志愿者70例为对照,对mtDNAD-loop区进行扩增并测序,比较两组mtDNA-loop区多态性差异。结果观察组和对照组mtDNA D-loop区共发现135个多态性位点,其中9个位点分布频率>5%,最终发现两组262位点基因型频率分布符合Hardy-Wenberg定律;观察组TT基因型及等位基因T频率分布为19.05%和38.89%,明显高于对照组(P<0.05);不同性别、年龄、病理分级和临床分期肾透明细胞癌患者mtDNA D-loop区262位点基因多态性分布差异无统计学意义(P>0.05);CC基因型和CT基因型患者中位生存时间分别为40.40个月和40.20个月,明显高于TT基因型患者的34.81个月,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论肾透明细胞癌患者mtDNA D-loop区262位点携带等位基因T的频率明显升高,但其与临床病理特征无明显关系,而与患者的预后有关,需进一步研究。

青海湖裸鲤繁殖群体线粒体基因组D-loop区序列多态性

利用PCR技术扩增青海湖3个不同地区(黑马河,布哈河,沙柳河)的青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii(Kessler))线粒体D-loop基因片段,测定该基因片段1 005 bp序列。通过线粒体基因组D-loop区序列比较分析,对比3个不同地区的83尾青海湖裸鲤的遗传结构进行研究,共检测出多态性位点65个,其中有1个插入位点(b3,nt-569),2个缺失位点(s6和b37,nt-169、nt-170),多态性位点数62。3个群体内的多态性位点分别为黑马河51个、布哈河38个、沙柳河39个,平均核苷酸位点差异数分别为9.377、7.782和7.510。结果表明,不同地区的遗传距离分别为黑马河群体与布哈河群体间的平均遗传距离最小(0.010 93),布哈河群体与沙柳河群体次之(0.014 23),黑马河群体与沙柳河群体的遗传平均距离最大(0.019 09)。3个群体间的遗传平均距离都在0.01以上,而且3个群体间总的遗传分化指数为0.019 26,基因流为12.73。UPGMA法构建的分子系统树中,沙柳河群体聚成一支,黑马河和布哈河群体混杂在一起,聚成一支。从序列差异的分析中得出,沙柳河群体与黑马河和布哈河群体的亲缘关系较远;黑马河和布哈河群体亲缘关系较近。以上数据还表明,青海湖裸鲤3个繁殖群体间具有较弱的遗传分化,洄游到同一河流里进行交配繁殖的群体内基因交流作用比较大。

白血病患者线粒体基因组D-loop区基因不稳定性研究

目的:探讨白血病患者线粒体基因组D-loop区基因的不稳定性。方法:采用PCR扩增24例患者D-loop区HV-1和HV-2两个高变区并测序,其结果与剑桥标准序列(rCRS)和mtDB数据库进行比对,分析其突变情况。采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析。结果:23例患者D-loop区发生突变,突变率95.83%(23/24);共检测到82个基因突变,其中HV-1区47个(57.32%),HV-2区35个(42.68%)。急性髓系白血病患者中未治疗组(UT)与治疗组(T)对比:突变率分别为(2.37±0.82)×10-3和(4.76±2.45)×10-3,其差异有统计学意义(P<0.01)。急性髓系白血病治疗组中部分缓解组(PR)和完全缓解组(CR)突变率比较显示,突变率分别为(5.10±2.56)×10-3和(4.51±2.51)×10-3,其差异无统计学意义(P>0.05)。M3组间比较显示,未治疗组(UT)、部分缓解组(PR)和完全缓解组(CR)突变率分别为(2.55±0.63)×10-3,(5.37±3.41)×10-3和(3.71±1.65)×10-3,其差异无统计学意义(P>0.05)。结论:D-loop区中存在较高的突变率和多种突变类型,具有较强的不稳定性;化疗可能加剧D-loop区基因的不稳定性。

喉癌中线粒体DNA拷贝数和D-loop区基因突变与临床病理的相关性

目的探讨喉癌线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数和D-loop区基因突变与临床病理特征的相关性。方法收集武汉市第一医院诊治的40例喉癌患者,取mt DNA的CoxⅡ和核DNA的β-actin为目的片段进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)扩增,对mt DNA D-loop区进行测序。结果喉癌组织中mt DNA拷贝数(0. 925±0. 136)高于其对应癌旁组织(0. 815±0. 096),两者差异有统计学意义(P <0. 05)。mt DNA拷贝数与患者淋巴结转移相关(P <0. 05),但与患者性别、吸烟、饮酒、肿瘤分期以及肿瘤分化无关。40例喉癌中有21例(52. 50%) mt DNA D-loop区共检测17个突变位点、34个突变;发现86个多态性位点;且mt DNA D-loop区基因突变与患者淋巴结转移和肿瘤分化程度相关(P均<0. 05),其与患者性别、吸烟、饮酒以及肿瘤分期无关。结论喉癌组织中mt DNA拷贝数高于其对应癌旁组织,且mt DNA Dloop区存在高频基因突变,提示mt DNA拷贝数变化以及D-loop区基因突变与喉癌的发生、发展密切相关。

大鳞副泥鳅群体线粒体DNA D-loop序列遗传变异分析

为探明大鳞副泥鳅野生资源状况,利用线粒体DNA D-loop序列,对天津5个大鳞副泥鳅自然群体的遗传多样性、遗传结构及种群历史动态进行分析。5个群体72个个体的D-loop基因序列全长912~914bp,其中多态性位点30个,共检测到22个单倍型,平均单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.813和0.0015,呈现高单倍型多样性和低核苷酸多样性的模式。5个群体间的遗传分化指数为-0.0205~0.0795,总的遗传分化指数为0.0712,属中等程度的遗传分化。单倍型网络进化图和单倍型系统发育树均未显示出明显的地理分布格局,中性检验和核苷酸不配对分布分析均表明,大鳞副泥鳅经历过种群扩张,扩张事件发生在第四纪更新世晚期。研究结果表明,应加强5个湿地大鳞副泥鳅群体的保护,适时开展大鳞副泥鳅良种选育工作,减少对大鳞副泥鳅野生资源的破坏。

基于cytb和D-loop的4个大泷六线鱼群体遗传多样性分析

利用线粒体DNA的细胞色素b(cytb)和控制区(D-loop)的部分序列来研究大泷六线鱼4个群体(包括野生和养殖群体)的遗传多样性。PCR扩增后分别得到365bp(cytb)和387bp(D-loop)的碱基序列。Mega计算结果显示cytb中A+T的含量(52.6%)高于G+C的含量(47.3%);D-loop中A+T的含量(69.3%)同样高于G+C的含量(30.7%)。4个群体平均的变异位点、单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数,cytb基因分别为10,7.75,0.739,0.007 3和2.656;D-loop区分别为18.25,12.75,0.846,0.012 1和4.673。4个群体的遗传多样性由高到低分别为舟山、大连、琅琊台、即墨养殖群体,养殖群体的多样性低于野生群体。基于野生群体cytb和D-loop的分子变异分析(AMOVA)得出的Fst分别为0.318 6和0.271 4,显示了变异主要发生在群体内部。基于Kimura 2-parameter模型构建的NJ树结果表明3个野生群体间没有显著的分化。线粒体cytb基因和D-loop区均可作为检测大泷六线鱼遗传多样性的有效标记。

交叉引物等温扩增检测猪肉源性成分

肉制品掺假现象已成为我国食品行业重点关注的问题。本研究使用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA)和核酸试纸条检测相结合的方法快速检测肉制品中猪肉成分。对猪线粒体的D-loop基因序列设计特异性的引物和探针,通过优化引物浓度及反应条件,确立最佳反应体系。实验结果表明,CPA扩增系统对猪源性成分的检测特异性良好,对单猪源性成分的检出限为1 ng/μL,对混合肉制品中猪源性成分的检出比例为10%(相当于10 ng/μL)。同时核酸试纸条可以快速检测CPA扩增产物,结果与凝胶电泳系统检测保持一致。本研究建立的CPA-核酸试纸条检测方法是一种特异、高效的肉制品中猪肉成分检测方法,可以为肉制品质量控制提供有效的新手段。

CPA-核酸试纸条检测鸭肉源性成分方法的建立和优化

为建立简单、有效的动物源性成分定性检测方法,根据交叉引物恒温扩增技术(CPA)原理,以鸭属线粒体D-loop基因序列设计引物和探针,优化反应体系与恒温扩增条件,并配合核酸试纸条显色,建立鸭肉源性成分的快速检测方法。结果表明,建立的鸭D-loop基因CPA扩增体系中交叉引物、内引物、外引物分别为0.6、0.3、0.1μmol·L-1,Mg SO4为8 mmol·L-1。在63℃、60min恒温扩增条件下,单一鸭源性DNA成分检出限为0.1 ng·μL-1,对混合肉制品中鸭肉成分的检出比例为1%(相当于1ng·μL-1)。本研究建立的鸭源性成分检测方法为肉制品掺假鉴定提供了有效的手段。

基于实时荧光PCR技术鉴别梅花鹿

目的建立基于TaqMan实时荧光PCR技术鉴别梅花鹿的分析方法。方法通过对梅花鹿线粒体D-loop基因序列比对分析,选取梅花鹿D-loop基因特异位点作为扩增靶序列,设计梅花鹿特异性的引物和TaqMan探针,并用已知样本对引物和TaqMan探针的物种特异性、灵敏性进行验证。结果该引物和探针对梅花鹿成分检测具有较强的特异性,与其他物种DNA无交叉扩增,该方法的检测灵敏度为0.01ng/μL。结论本方法具有较高的特异性和灵敏度,适用于对肉类以及其他梅花鹿产品的物种的鉴别。

TaqMan探针实时荧光PCR对马鹿真伪鉴别方法的建立

随着人们生活水平的提高,对鹿产品的需求日益剧增。由于市场上优质鹿产品供不应求,许多不法分子借此鱼目混珠以次充好,导致掺假鹿及其衍生品泛滥,因此急需一种简单快速鉴别鹿产品真伪的方法。本研究对马鹿线粒体D-loop基因特异位点进行分析比对,并作为扩增靶序列,设计马鹿特异性的引物和探针,通过对特异性以及方法灵敏度测试,建立了马鹿的特异性实时荧光PCR方法。该方法具有很高的特异性及灵敏性,检测灵敏性为0.00174 ng/μL,适用于鉴别马鹿及其相关产品的真伪。

线粒体基因组D-loop区基因多态性与年龄及IVF-ET结局相关性

目的:研究线粒体基因组D-loop区基因的变异位点与年龄及IVF-ET或ICSI结局的相关性。方法:采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和基因片段直接测序方法测定检测167例行IVF-ET或ICSI治疗患者的外周血线粒体基因组D-loop区nt.128～599区域基因变异情况,比较不同年龄组(A组:<35岁,B组:≥35岁)变异位点、年龄及IVF-ET或ICSI结局之间的关系。结果:共有20个变异位点,其中5个为新发现的变异位点。B组的变异位点数(3.8±1.8)显著多于A组的2.6±1.3,其中nt.332C→T在A组发生率显著低于B组(2.2%vs12.2%,P=0.012),且变异位点数量与年龄间存在线性相关,相关系数为0.333。nt.332C→T、nt.249delA和nt.309del/inC三者的变异组年龄显著高于非变异组,nt.309del/inC变异组的累积胚胎平均评分显著低于非变异组(12.9±0.5vs15.5±0.7,P=0.013),nt.249 delA变异组的受精率及累积胚胎平均评分显著低于非变异组(66.86±27.28%vs75.63±21.42%,P=0.046)(12.0±0.7vs14.7±0.5,P=0.013),变异位点数量与受精率及累积胚胎平均评分间存在线性相关。结论:线粒体基因组D-loop区变异位点发生率与年龄相关,且影响IVF-ET/ICSI的受精率及胚胎质量。

小家鼠线粒体DNA控制区多态性和系统进化研究

目的研究小家鼠线粒体基因组控制区(D-loop)的遗传多态性,为国境口岸鼠类鉴定和溯源提供技术支持。方法以2011-2015年江苏口岸地区捕获的本底和输入性小家鼠为研究对象,设计引物扩增线粒体D-loop基因,对扩增产物进行测序后获得D-loop基因序列,进行基因多态性分析和遗传进化研究。结果共获得21条国内外小家鼠D-loop基因序列,共有17个单倍型,测出533个序列位点,其中保守位点488个,可变异位点41个,核苷酸平均差异数为14.752 38。对21只小家鼠构建遗传进化树,分为3个分支。结论小家鼠种群具有丰富的种内差异,其遗传进化规律与地理分布存在显著的相关性。