胱硫醚β合成酶通过AKT/cyclin D1通路影响肺腺癌A549细胞的增殖

目的:探究胱硫醚β合成酶(CBS)通过AKT/cyclin D1通路影响肺腺癌A549细胞的增殖及其分子机制。方法:通过cBioPortal数据库分析肺腺癌组织中CBS和AKT/cyclinD1相关蛋白的表达,收集的国人肺腺癌组织通过免疫荧光法验证CBS的表达。WB法检测A549细胞及其移植瘤中半胱氨酸代谢和AKT/cyclin D1通路相关蛋白的表达。将pCW57.1-myrAKT质粒分别与RNA干扰对照质粒pGIPZ-CBS-nc-shRNA、干扰质粒pGIPZ-CBS-shNRA1和pGIPZ-CBS-shNRA2共转染A549细胞,共转染组又分多西环素(DOX)诱导组(DOX^(+))和不诱导组(DOX^(-)),通过细胞集落形成实验检测转染后各组A549细胞的集落形成能力。通过CBS^(wt) A549细胞、CBS^(I278T)A549细胞移植瘤实验检测过表达CBS对移植瘤生长的影响,AzMC荧光染色法和免疫组织化学法分别检测移植瘤组织中H_(2)S水平和Ki-67阳性率。结果:数据库分析和国人组织标本检测均显示,与癌旁组织比较,肺腺癌中CBS呈低表达(均P<0.01);与SV-40细胞比较,A549、SKMES1和NCIH460细胞中CBS蛋白呈低表达(均P<0.01),而p-AKT和cyclin D1蛋白均呈高表达(均P<0.01)。A549细胞中过表达AKT显著促进细胞集落的形成(P<0.01),在此基础上敲减CBS可进一步促进细胞集落的形成(均P<0.01)。移植瘤实验显示,与DOX^(-)CBS^(WT)组比较,DOX^(+)CBS^(WT)组中CBS、RB和P21蛋白表达升高、H_(2)S含量增加、肿瘤体积变小、Ki-67阳性率降低(均P<0.01);与DOX^(-)CBS^(I278T)组比较,DOX^(+)CBS^(I278T)组中CBS表达升高(P<0.01),但H_(2)S水平和移植瘤体积变化均不明显。结论:肺腺癌组织和A549细胞中CBS呈低表达,而AKT/cyclin D1通路呈激活状态,过表达或敲减CBS可抑制或促进A549细胞及其移植瘤的生长,CBS和AKT/cyclin D1通路相关蛋白可能是肺腺癌的潜在靶点和标志物。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路探讨苓桂气化方改善射血分数保留心力衰竭早期舒张功能的分子机制

目的观察苓桂气化方对射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)早期模型大鼠心脏舒张功能的干预效应,基于核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)/胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(cysteine-containing aspartate-specific proteases-1,Caspase-1)/消皮素D(Gasdermin D,GSDMD)通路探讨其潜在的分子作用机制。方法40只自发性高血压大鼠高盐高脂高糖饮食联合腹腔注射链脲佐菌素溶液建立HFpEF早期大鼠模型,分为HFpEF组、恩格列净组(1.8 mg/kg)、苓桂气化方低剂量组(4.96 g/kg)、苓桂气化方高剂量组(9.92 g/kg),予相应药物灌胃;正常血压组、空白组予等剂量生理盐水灌胃,连续干预9周。采用超声心动图检测大鼠左心房内径(left atrial diameter,LAD)、舒张早期二尖瓣血流速度(left ventricular early diastolic filling peak velocity,E)与舒张晚期二尖瓣血流速度(atrial systolic left ventricular filling peak velocity,A)比值、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF);酶联免疫吸附测定法检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)含量;苏木精—伊红染色观察心肌组织病理变化;蛋白质印迹(Western Blot,WB)法检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD和白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达。结果与正常血压组相比,HFpEF组LAD和E/A增加(P<0.05),LVEF无明显变化(P>0.05);血清ANP含量升高(P<0.05);病理观察显示心肌炎症浸润;WB结果示NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白含量升高(P<0.05),表明建模成功。与HFpEF组比,恩格列净组和苓桂气化方低、高剂量组的LAD和E/A减小(P<0.05),血清ANP含量降低(P<0.05),病理观察显示心肌炎症浸润减轻,WB结果示恩格列净组NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),苓桂气化方低剂量组NLRP3、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),苓桂气化方高剂量组NLRP3、GSDMD、IL-1β蛋白含量降低(P<0.05),其余蛋白含量有下降趋势。结论苓桂气化方能改善HFpEF早期模型大鼠心脏舒张功能,其机制可能与调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路、减轻心肌炎症浸润、抑制心房重构相关。

瑞马唑仑调节NLRP3/caspase-1/GSDMD信号通路对LPS诱导的神经元焦亡的影响

目的 探讨瑞马唑仑(REM)调节Nod样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的神经元焦亡的影响。方法 将对数期小鼠海马神经元HT22细胞随机分为正常对照组(Ctrl组)、LPS诱导组(LPS组,10 mg/L LPS)、低浓度REM组(REM-低组,160μmol/L REM)、高浓度REM组(REM-高组,320μmol/L REM)和REM-高+NLRP3激活剂尼日利亚菌素组(REM-高+尼日利亚菌素组,320μmol/L REM+10μmol/L尼日利亚菌素)。除Ctrl组外,其余各组HT22细胞均使用LPS进行诱导。各组加药处理后,采用细胞计数试剂盒8测定HT22细胞的吸光度(A值)。采用Hoechst33342/碘化吡啶(PI)染色检测HT22细胞焦亡率。采用酶联免疫吸附试验检测HT22细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测HT22细胞中NLRP3信使RNA(mRNA)、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表达水平。采用蛋白质印迹法检测HT22细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD和凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达水平。结果 LPS组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著低于Ctrl组(P<0.05),而细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平均显著高于Ctrl组(P<0.05)。REM-低组和REM-高组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著高于LPS组,且REM-高组高于REM-低组,差异均有统计学意义(P<0.05),而REM-低组和REM-高组HT22细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平显著低于LPS组,且REM-高组低于REM-低组,差异均有统计学意义(P<0.05)。REM-高+尼日利亚菌素组HT22细胞48、72 h的A_(450)值显著低于REM-高组(P<0.05),而细胞焦亡率、上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA和蛋白表达水平、ASC蛋白表达水平均显著高于REM-高组(P<0.05)。结论 REM可能通过下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路减轻LPS诱导的神经元焦亡。

安石榴苷通过Akt/NF-κB/Cyclin D1通路对幼龄哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探究安石榴苷对幼龄哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖凋亡及蛋白激酶B(Akt)/核因子-κB(NF-κB)/细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)通路的影响。方法:幼龄SD大鼠设置正常组、哮喘组(建模)和安石榴苷低、中、高剂量组(建模+灌胃10、20、40 mg/kg安石榴苷)。分离、培养哮喘大鼠ASMC,分为对照组和安石榴苷低、中、高浓度组(0、100、200、400μmol/L安石榴苷)。结果:与正常组相比,哮喘组幼龄大鼠体质量、最大呼气流量(PEF)、0.2秒用力呼气容积占用力肺活量比率(FEV0.2/FVC)降低(P<0.05),肺组织中p-Akt/Akt、NF-κB p-p65/NF-κB p65、Cyclin D1/GAPDH蛋白表达水平升高(P<0.05),肺组织出现明显的病理损伤;与哮喘组相比,安石榴苷低、中、高剂量组体质量、PEF、FEV0.2/FVC升高(P<0.05),肺组织中p-Akt/Akt、NF-κB p-p65/NF-κB p65、Cyclin D1/GAPDH蛋白表达水平降低(P<0.05),且均呈剂量依赖(P<0.05),肺组织炎性细胞浸润、气管平滑肌增厚情况逐渐减轻。结论:安石榴苷可抑制Akt/NF-κB/Cyclin D1通路激活,抑制ASMC细胞增殖并诱导细胞凋亡,进而减轻幼龄哮喘大鼠病情。

LncRNA OCPAT1通过调控miR-320d/YOD1信号通路促进卵巢癌的发生及发展

目的研究lncRNA OCPAT1调控miR-320d/YOD1信号通路在卵巢癌发生发展中的作用及机制。方法2019年1月至2020年12月应用TCGA和GTEX数据库筛选,通过qRT-PCR检测确认lncRNA AC007405.3(OCPAT1)在卵巢癌组织和细胞中的表达;在ES-2细胞中敲减OCPAT1,通过实验验证,OCPAT1与miR-320d/YOD1的靶向调控关系。结果通过GTEX和TCGA数据库及qRT-PCR检测,确认OCPAT1高表达;敲低OCPAT1后,MTT增殖显示敲减后细胞增殖减低,EdU细胞增殖显示,敲减后处于复制期的细胞减少,流式细胞周期显示敲减后细胞停滞在G0/G1期,流式周期显示敲减后细胞凋亡增加,Transwell migration实验显示,敲减后抑制卵巢癌细胞ES-2的迁移能力,Matrigel invasion实验显示敲减后抑制卵巢癌细胞ES-2的侵袭能力。双荧光素酶报告基因实验证实,OCPAT1可以靶向作用于miR-320d。结论lncRNA OCPAT1可能通过靶向调控miR-320d/YOD1信号通路调控卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭,进而促进卵巢癌的发生及发展。

原钙黏蛋白10通过NF-κB/cyclin D1信号通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖

目的:探讨原钙黏蛋白10(PCDH10)对人乳腺癌细胞的增殖抑制作用及机制。方法:采用RTPCR法检测4种人乳腺癌细胞和正常乳腺上皮MCF-10A细胞中PCDH10的mRNA表达;将PCDH10慢病毒表达载体(pLV-PCDH10)感染MDA-MB-231细胞,建立稳定表达PCDH10的细胞系,同时设置空白对照(blank)和阴性对照(pLV-NC)细胞;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和集落形成实验检测细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测细胞周期变化;Western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、核因子κB p65亚基(NF-κB p65)和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)蛋白表达。结果:人乳腺癌细胞中PCDH10的mRNA水平表达均低于正常乳腺上皮MCF-10A细胞(P<0.05)。经RT-PCR与Western blot验证,稳定过表达PCDH10的人乳腺癌MDA-MB-231细胞构建成功;与pLV-NC组相比,过表达PCDH10可显著抑制细胞增殖(P<0.05),诱导细胞发生G1期阻滞;Western blot结果表明,同pLV-NC组比较,过表达PCDH10可显著下调cyclin D1和CDK4蛋白表达,降低NF-κB p65和IκBα蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。结论:PCDH10可抑制乳腺癌细胞增殖,阻滞细胞周期进程,其机制可能与NF-κB/cyclin D1信号通路有关。

MOB1蛋白通过调控AKT/Cyclin D1信号通路促进肝癌细胞增殖

目的探讨MOB1蛋白在肝癌中的作用及其调控机制。方法利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析MOB1在肝癌中的表达水平及其与患者生存期的关系。利用Western blotting验证MOB1蛋白在肝癌组织样本中的表达情况。用siRNA敲低MOB1表达,慢病毒构建MOB1稳定过表达细胞系,CCK-8法检测MOB1蛋白对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术检测MOB1蛋白对肝癌细胞周期的影响。Western blotting检测关键信号通路蛋白水平的表达。结果通过TCGA数据库分析,同源基因MOB1a和MOB1b在肝癌样本集中存在显著高表达,且肿瘤样本高表达MOB1a和MOB1b基因与患者的生存期缩短显著相关。在临床样本分析中,MOB1在86.7%的肝细胞癌患者肿瘤组织中显著高表达。MOB1过表达后Huh7和HepG2细胞的增殖速度显著上升,G_(2)/M期细胞比例显著上升。反之,MOB1敲低后,Huh7和HepG_(2)细胞的增殖速率显著下降,G2/M期细胞比例显著下降。进一步研究发现,MOB1蛋白过表达不影响经典的Hippo-YAP信号通路,但能促进AKT蛋白的磷酸化和提高Cyclin D1水平。结论MOB1蛋白可能通过调节AKT/Cyclin D1信号通路促进肝癌细胞增殖,影响疾病进展。

基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路探讨补中益气汤干预NOD.H-2^(h4)小鼠AIT细胞焦亡的机制

目的:基于NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶-1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)通路探讨补中益气汤对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠细胞焦亡的作用机制。方法:60只NOD.H-2h4小鼠分为正常组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量(4.10、8.19、16.38 g·kg^(-1))组和硒酵母片(0.26 mg·kg^(-1))组,每组10只。除正常组外,其余各组均给予0.05%碘化钠(NaI)灌胃8周造模,继续给药干预8周。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(Tg Ab)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠甲状腺组织病理学改变;免疫组化法检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测甲状腺组织中细胞焦亡相关蛋白水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠血清TPO-Ab、Tg Ab水平显著升高(P<0.01),甲状腺滤泡或增大呈立方状,或破坏萎缩,滤泡周围可见大量淋巴细胞浸润;与模型组比较,给药组TPO-Ab、Tg Ab水平显著降低(P<0.01),滤泡形态结构有所改善,淋巴细胞浸润程度有所减轻,其中补中益气汤中剂量组降低和改善效果最为明显。与正常组比较,模型组小鼠甲状腺组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达显著增加(P<0.01),NLRP3、剪切的(cleaved) Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,给药组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白阳性产物和mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),其中补中益气汤中剂量组降低效果最为明显,给药组NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD-N蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论:补中益气汤可改善AIT,其机制可能是通过调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制细胞焦亡实现的。

四磨汤调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路对功能性消化不良大鼠十二指肠微炎症的影响

目的探讨四磨汤对功能性消化不良(FD)大鼠十二指肠微炎症及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/胱天蛋白酶1(Caspase-1)/消皮素D(GSDMD)信号通路的影响。方法用多因素方法建立FD模型。将SD大鼠随机分成正常组、模型组(FD模型)、阳性对照组(灌胃给药0.305 mg·kg^(-1)莫沙必利)和高、中、低剂量实验组(分别灌胃给药5.62、2.81、1.40 g·kg^(-1)四磨汤)。测定小肠推进率、胃排空率;用酶联免疫吸附试验法(ELISA)测定血清中白细胞介素(IL)-1β、IL^(-1)8水平;用蛋白质印迹法检测十二指肠组织NLRP3、GSDMD的蛋白表达情况。结果正常组、模型组、阳性对照组和高、中、低剂量实验组胃排空率分别为(58.34±5.72)%、(29.16±8.37)%、(48.77±6.10)%、(48.35±6.04)%、(48.20±3.49)%和(39.24±4.20)%;小肠推进率分别为(82.01±7.55)%、(41.95±9.53)%、(64.61±10.18)%、(75.04±9.76)%、(60.58±7.13)%和(45.89±7.40)%;血清IL^(-1)β水平分别为(12.86±0.88)、(43.73±4.60)、(18.84±0.86)、(24.61±1.57)、(19.14±0.77)和(29.04±0.72)pg·mL^(-1);IL^(-1)8水平分别为(95.00±3.74)、(170.60±8.78)、(108.50±3.05)、(118.90±3.45)、(99.90±8.70)和(141.00±3.71)pg·mL^(-1);NLRP3蛋白表达水平分别为0.32±0.02、0.84±0.05、0.42±0.03、0.48±0.02、0.61±0.04和0.62±0.05;GSDMD蛋白表达水平分别为0.34±0.05、0.93±0.06、0.35±0.03、0.52±0.02、0.53±0.06和0.55±0.05。模型组上述指标与正常组比较,高剂量实验组、阳性对照组上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论四磨汤能够有效改善FD大鼠一般状况及十二指肠微炎症,其机制可能与抑制十二指肠NLRP3/Caspase-l/GSDMD信号通路有关。

雷公藤甲素脂质体对乳腺癌的抑制作用及其对PI3K/Akt/Cyclin D1信号通路的影响

该研究采用薄膜分散法制备了雷公藤甲素脂质体(1-Lips),表征了其理化性质;并采用乳腺癌荷瘤小鼠考察了其抑瘤效应及对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/细胞周期蛋白D1(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinaseB/Cyclin D1,PI3K/Akt/Cyclin D1)信号通路的影响。结果表明,1-Lips具有磷脂双分子层与类球形结构,平均粒径为(113.7±2.0)nm,ζ电位为(–1.1±0.6)mV,1平均包封率为(90.48±1.24)%。抗乳腺癌试验结果显示,1-Lips能显著减小荷瘤小鼠肿瘤体积,破坏肿瘤组织结构,抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡,并抑制PI3K、p-Akt、Cyclin D1、CDK4蛋白表达,增加p21蛋白表达。该结果证明1-Lips能够增强1的抗肿瘤作用,且抗肿瘤作用机制可能与抑制PI3K/Akt/Cyclin D1信号通路有关。

蒲公英多糖通过下调LncRNA CCAT1表达抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移和侵袭

目的通过观察蒲公英多糖(dandelion polysaccharide,DP)联合小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默长链非编码RNA(LncRNA)结肠癌相关转录因子1(colon cancer-associated transcript 1,CCAT1)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,探究DP抗乳腺癌可能的分子机制。方法在线数据工具分析CCAT1在乳腺癌组织中的差异表达,qRT-PCR分别检测CCAT1在乳腺癌细胞系中的差异表达、DP(100、200μg/mL)对MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响以及siCCAT1对MDA-MB-231细胞中CCAT1表达的影响;CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验分别检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力、迁移和侵袭能力的影响;在线数据工具预测CCAT1下游靶基因及靶基因富集的信号通路;Western blotting检测DP联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞EMT相关蛋白及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)/细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)/周期蛋白依赖性激酶6(cyclin-dependent kinases 6,CDK6)信号通路中关键蛋白表达的影响。结果与癌旁正常组织及正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,CCAT1在人乳腺癌组织和细胞中高表达(P<0.01);与对照组比较,DP呈剂量和时间相关性地抑制MDA-MB-231及MCF-7细胞活力(P<0.05、0.01),但对MCF-10A细胞活力无明显影响;与MCF-10A及MCF-7细胞相比,DP可显著下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达水平(P<0.01);与siNC组比较,siRNA可显著降低CCAT1在MDA-MB-231细胞中的表达(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1更加显著降低了MDA-MB-231细胞中CCAT1的表达水平(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞活力(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用更为明显(P<0.01);与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭(P<0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1抑制MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的作用更为明显(P<0.01);与单独用DP或siCCAT1相比,DP联合siCCAT1处理MDA-MB-231细胞中EMT进程相关蛋白E-cadherin表达上调更为显著(P<0.01),N-cadherin和Vimentin蛋白表达下调更为显著(P<0.01);在线生物工具预测出CCAT1靶基因共1929个,这些靶基因主要富集在RNA聚合酶II启动子转录调控、信号转导、转录调控等关键生物过程;富集的通路主要有癌症、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路;与对照组及siNC组比较,DP(200μg/mL)和siCCAT1均能下调MDA-MB-231细胞中Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路关键蛋白p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β、Cyclin D1、CDK6蛋白表达水平(P<0.05、0.01),且DP(200μg/mL)联合siCCAT1应用时对其关键蛋白下调作用更为显著(P<0.01)。结论DP联合siCCAT1显著抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭和EMT进程,其机制可能与下调MDA-MB-231细胞中CCAT1表达进而抑制Akt/GSK-3β/Cyclin D1/CDK6信号通路有关。

阿司匹林调控NLRP3/caspase-1/GSDMD通路介导的焦亡途径减轻脂多糖诱导的急性肺损伤研究

目的探究阿司匹林(aspirin)对急性肺损伤(acute lung injury,ALI)时细胞焦亡的影响及机制。方法动物实验将SD大鼠分为对照组(control)、模型组(model)、模型+阿司匹林组(model+aspirin),每组各10只。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射复制ALI大鼠模型。细胞实验将人支气管上皮细胞(BEAS-2B)分为control组、LPS组及LPS+aspirin组。HE染色观察肺组织形态、测定肺湿/干质量比(W/D)、酶联免疫吸附法(ELISA)测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)含量、碘化丙啶(PI)染色检测细胞焦亡率、Western blot检测NLRP3/caspase-1/GSDMD通路蛋白表达。利用Lipofectamine®2000构建NLRP3过表达,检测过表达对aspirin抑制LPS诱导BEAS-2B细胞焦亡及NLRP3/caspase-1/GSDMD通路的影响。结果与control组相比,model组大鼠肺组织出现明显病理损伤,W/D,IL-1β、IL-18含量以及NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD-N蛋白表达均明显增加。Aspirin处理后能够改善ALI大鼠肺组织损伤,降低上述指标。与动物实验结果一致,LPS能够激活NLRP3/caspase-1/GSDMD通路诱导的BEAS-2B焦亡。Aspirin处理后能够抑制LPS对BEAS-2B细胞焦亡作用。与LPS+aspirin组相比,过表达NLRP3能够逆转aspirin对LPS诱导BEAS-2B细胞焦亡作用,促进NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD-N蛋白表达。结论Aspirin能够通过调控NLRP3/caspase-1/GSDMD通路并抑制LPS诱导的ALI细胞焦亡,改善肺损伤。

对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32对胰腺癌细胞的作用及机制

目的探讨对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32对胰腺癌细胞SW1990的作用及机制。方法将SW1990细胞随机分为对照组、0.5μmol·L^(-1) J32组、1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组,分别用含终浓度0.0、0.5、1.0、2.0、4.0μmol·L^(-1) J32的培养基培养。采用细胞划痕试验检测细胞迁移能力,单克隆形成试验检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况、细胞中活性氧水平及细胞周期,磷酸化H2组蛋白家族成员X(γ-H2AX)免疫荧光法检测细胞DNA损伤程度,Western blot法检测共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)-细胞周期检查点激酶1(Chk1)-p53-细胞周期素D1(Cyclin D1)通路相关蛋白以及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达。结果培养24、48 h时,1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力显著低于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力均显著低于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的迁移能力显著低于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。0.5μmol·L^(-1) J32组、1.0μmol·L^(-1) J32组细胞的增殖能力显著低于对照组(P<0.05),1.0μmol·L^(-1) J32组细胞的增殖能力显著低于0.5μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的凋亡率显著高于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05),4.0μmol·L^(-1) J32组细胞的活性氧水平显著高于2.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组细胞的DNA损伤程度显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组细胞的DNA损伤程度显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组细胞中G 1/S期细胞占比显著高于对照组(P<0.05),2.0μmol·L^(-1) J32组细胞中G 1/S期细胞占比显著高于1.0μmol·L^(-1) J32组(P<0.05)。对照组、1.0μmol·L^(-1) J32组、2.0μmol·L^(-1) J32组、4.0μmol·L^(-1) J32组细胞中,随着J32浓度的增加,磷酸化ATR/ATR值及磷酸化p53蛋白表达呈升高趋势(F=25.534、3.970,P<0.05),Chk1、CyclinD1蛋白表达呈降低趋势(F=19.532、0.485,P<0.05);促凋亡蛋白caspase-3、Bax的表达呈升高趋势(F=0.219、4.314,P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达呈下降趋势(F=0.324,P<0.05)。结论对映-贝壳杉烯型二萜类化合物J32可呈浓度依赖性地抑制胰腺癌SW1990细胞的迁移和增殖、促进细胞凋亡及提高细胞内活性氧水平,此外,J32可促进细胞发生DNA损伤及细胞周期阻滞,其作用机制可能与ATR-Chk1-p53-Cyclin D1通路相关。

石菖蒲挥发油有效成分β-细辛醚联合左旋多巴对6-OHDA诱导帕金森模型大鼠的分子伴侣介导自噬的影响

目的:研究石菖蒲挥发油有效成分β-细辛醚联合左旋多巴(L-dopa)对6-羟基多巴(6-OHDA)诱导帕金森(PD)模型大鼠的分子伴侣介导自噬(CMA)的影响。方法:将SD大鼠通过脑立体定位仪于内侧前脑束(MFB)处注射6-OHDA制备PD模型大鼠。将60只PD大鼠随机分为5组,每组12只,即模型组、MEF2D抑制剂(SB203580,0.5 mg/kg)组、MEF2D激活剂(LiCl,100 mg/kg)组、β-细辛醚(15 mg/kg)组、联合用药组(L-dopa 60 mg/kg+β-细辛醚15 mg/kg)组。给药组按上述剂量灌胃给药,2次/d,持续30 d。而假手术组和模型组按0.5 mL/kg灌胃蒸馏水,2次/d。实验结束后ELISA法检测α-syn、TH、LAMP-2A、HSP70、MEF2D水平,RT-PCR法和Western blot法检测Beclin-1、HSP70、HSC70、MEF2D mRNA及蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组α-syn和Beclin-1显著升高,TH、LAMP-2A、HSP70、MEF2D、HSC70显著降低(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,MEF2D抑制剂组的α-syn显著升高,Beclin-1、TH、LAMP-2A水平及HSP70、MEF2D、HSC70 mRNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01),而LiCl组、β-细辛醚组和联合用药组的α-syn、Beclin-1显著降低,TH、LAMP-2A水平及HSP70、MEF2D、HSC70 mRNA表达显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:石菖蒲挥发油有效成分β-细辛醚与L-dopa联合用药通过调节HSP70/MEF2D/Beclin-1分子伴侣介导的自噬通路降低6-OHDA诱导PD大鼠中多巴胺能神经元的损伤。

基于Nrf2/D1R-ERK信号通路探讨甘松对左旋多巴诱导的异动症大鼠的作用机制

目的基于Nrf2/D1R-ERK信号通路探讨甘松Nardostachys jatamansi对左旋多巴(levodopa,L-DOPA)诱导的异动症(levodopa-induced dyskinesia,LID)模型大鼠的作用机制。方法将SD大鼠随机分为假手术组、帕金森(Parkinson’s disease,PD)组、L-DOPA组和甘松+L-DOPA组。PD组、L-DOPA组和甘松+L-DOPA组颈背部sc鱼藤酮葵花籽油(1.5mg/kg)14 d制备PD模型,假手术组sc等体积葵花籽油,之后进行14 d的药物干预:L-DOPA组ig L-DOPA(100 mg/kg)和苄丝肼(25 mg/kg),甘松+L-DOPA组ig甘松(1240 mg/kg)、L-DOPA(100 mg/kg)和苄丝肼(25 mg/kg),假手术组和PD组ig等体积0.9%氯化钠溶液。通过前肢功能检测实验评估L-DOPA对PD大鼠运动能力的影响;通过异常不自主运动(abnormal involuntary movement,AIM)评分评估L-DOPA导致LID大鼠的AIM程度;采用免疫组化法考察大鼠黑质中酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的表达;Western blotting法检测大鼠纹状体内转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)、多巴胺D1受体(dopamine D1 receptor,D1R)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、磷酸化ERK(phosphorylated ERK,p-ERK)和ΔFosB蛋白的表达;ELISA法检测大鼠脑纹状体中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、多巴胺和c AMP调节的磷蛋白-32(dopamine and adenosine 3′,5′-monophosphate-regulated phospho-protein,DARPP-32)和p-DARPP-32的含量。结果前肢功能检测结果显示,L-DOPA单用和甘松与L-DOPA联用均能显著增加PD大鼠的前肢跨步次数(P<0.001)。AIM评分结果显示,与L-DOPA单用相比,甘松与L-DOPA联用可显著降低LID大鼠的AIM症状(P<0.01)。免疫组化结果显示,PD组和L-DOPA组的TH表达没有显著性差异,而甘松与L-DOPA联用可明显增强PD大鼠的TH表达(P<0.05),同时显著增强L-DOPA单用导致的LID大鼠的TH表达(P<0.01)。Nrf2信号通路结果显示,PD组和L-DOPA组没有显著性差异,而甘松与L-DOPA联用可明显降低PD大鼠的ROS含量(P<0.05),显著促进Nrf2表达(P<0.01),并显著提高HO-1、SOD、GSH-Px的含量(P<0.001);同时还能显著降低LID大鼠的ROS含量(P<0.001),明显提高Nrf2、HO-1、SOD的含量(P<0.05),并显著提高GSH-Px含量(P<0.01)。D1R-ERK信号通路结果显示,甘松与L-DOPA联用能显著降低LID大鼠的D1R表达(P<0.001),同时明显减低ΔFosB、p-DARPP-32/DARPP-32、p-ERK/ERK的表达(P<0.05)。结论 L-DOPA可以改善PD大鼠的运动障碍,但不能降低TH的损伤,而且还会引起氧化应激反应和D1R-ERK通路的过表达。甘松联合L-DOPA给药可明显改善PD大鼠的运动损伤,抑制L-DOPA引起的AIM现象,同时提高TH的表达。其机制可能是甘松通过激活Nrf2通路相关蛋白的表达,并抑制D1R-ERK通路相关蛋白的过表达发挥抗LID作用。

高良姜素通过调节Akt/MEF2D/Beclin-1信号通路改善APP/PS1双转基因小鼠学习记忆障碍的作用

研究高良姜素对APP/PS1小鼠学习记忆障碍及Akt/MEF2D/Beclin-1通路的影响。实验分为正常组、模型组、高良姜素低剂量组(25 mg·kg^(-1))、高良姜素中剂量组(50 mg·kg^(-1))、高良姜素高剂量组(100 mg·kg^(-1))、多奈哌齐组(3 mg·kg^(-1))、Akt抑制剂组(25 mg·kg^(-1))和自噬抑制剂组(30 mg·kg^(-1)),每组10只,持续给药30 d,待给药第24天进行水迷宫和避暗实验测试;ELISA检测海马中p-tau、β-淀粉样多肽1-42(Aβ_(42))、乙酰胆碱酯酶(AChE)、淀粉样前体蛋白β位点裂解酶1(BACE1)和淀粉样前体蛋白(APP)水平,RT-PCR检测海马中Beclin-1 mRNA表达,免疫组化检测海马中Aβ_(42)和胶质纤维状酸性蛋白(GFAP)的表达,免疫荧光检测海马中肌细胞增强因子2D(MEF2D)的表达,HE染色观察海马病理学情况以及Western blot检测海马中Akt、MEF2D和Beclin-1表达。结果表明,与正常组比较,模型组游泳时间、错误次数、被电次数、p-tau、Aβ_(42)、APP、AChE、BACE1、GFAP和Beclin-1增加,避暗潜伏期、p-Akt和MEF2D减少,海马损伤明显。与模型组比较,多奈哌齐组和高良姜素组游泳时间、错误次数、被电次数、p-tau、Aβ_(42)、APP、AChE、BACE1、GFAP和Beclin-1减少,避暗潜伏期、p-Akt和MEF2D增加,海马组织病理情况改善。与自噬抑制剂组比较,高良姜素组游泳时间、错误次数、被电次数、p-tau、Aβ_(42)、APP、AChE、BACE1、GFAP和Beclin-1显著增加,避暗潜伏期、p-Akt和MEF2D显著减少。综上所述,高良姜素改善APP/PS1小鼠的学习记忆障碍和海马神经元损伤,其机制可能与调节Akt/MEF2D/Beclin-1通路有关。

三叶香茶菜对CCl_(4)致肝纤维化大鼠NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路的影响

目的:探讨三叶香茶菜对四氯化碳(CCl_(4))致肝纤维化大鼠炎症小体3 (NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3,NLRP3)/半胱天冬酶-1(Caspase-1)/消皮素D(gastermin D, GSDMD)信号通路的作用。方法:采用CCl_(4)致大鼠肝纤维化模型,给予三叶香茶菜治疗后,分别生化检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、C-IV型胶原(C-IV)、PC-III型前胶原(PC-III)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、Caspase-1、GSDMD的含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)及荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测大鼠肝组织中NLRP3蛋白和基因表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠体重显著下降(P<0.01),肝脏系数显著升高(P<0.01),ALT、AST活力、MDA、HA、LN、C-IV、PC-III、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18含量明显升高(P<0.05或P<0.01),NLRP3蛋白及mRNA水平明显上调(P<0.05或P<0.01),SOD活性明显下降(P<0.05),肝组织纤维化程度显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,三叶香茶菜20、40、80 g/kg组与秋水仙碱0.2 mg/kg组AST、HA、LN、C-IV、PC-III、Caspase-1、IL-1β及IL-18含量显著下降,Nlrp3 mRNA显著下调(P<0.01),SOD活性水平显著升高,肝组织纤维化程度显著下降(P<0.01),三叶香茶菜40、80 g/kg组ALT活力、MDA含量显著降低(P<0.01),20 g/kg组体重、肝系数、GSDMD含量明显降低(P<0.05),SOD活力明显升高(P<0.05)。结论:三叶香茶菜对CCl_(4)致大鼠肝纤维化有抵抗作用,其机制是下调NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路的活化,减少肝组织慢性炎症损伤。

miRNA-34b对子宫内膜癌细胞凋亡、侵袭、迁移的影响及作用机制

目的探究miR-34b对子宫内膜癌(endometrial cancer)凋亡、迁移、侵袭的影响及对Jag1/Cyclin D1信号通路的影响。方法将人子宫内膜癌细胞AN3CA细胞分为对照组、NC组和miR-34b组。通过流式细胞技术、Transwell实验分别检测各组细胞凋亡、迁移能力和侵袭能力;通过定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及Westernblot检测各组细胞Jagged-1蛋白(Jag1)及其靶基因G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cycling D1)mRNA和蛋白的表达水平;通过裸鼠荷瘤实验分析miR-34b对肿瘤生长的影响。结果对照组、NC组和miR-34b组细胞凋亡比例分别为5.6%±0.12%,5.80%±0.22%和19.4%±0.51%。miR-34组细胞凋亡比例高于对照组,差异具有统计学意义(t=8.325,P<0.01);对照组、NC组和miR-34b组细胞迁移数分别为322.15±13.71个,327.67±9.14个和162.19±7.49个,miR-34b组细胞迁移数低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.945,P<0.01);对照组、NC组和miR-34b组细胞侵袭数分别为357.6±14.11个,364.05±16.12个和157.58±8.77个,miR-34b组细胞侵袭数低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.643,P<0.01);qPCR结果表明对照组、NC组和miR-34b组Jag1 mRNA表达为2.75±0.21,2.67±0.14和1.19±0.19,miR-34b组低于对照组,差异具有统计学意义(t=8.434,P<0.01);对照组、NC组和miR-34b组蛋白表达为1.71±0.11,1.77±0.24和0.69±0.16,miR-34b组低于对照组,差异具有统计学意义(t=7.895,P<0.01);对照组、NC组和miR-34b组Cyclin D1mRNA表达为1.29±0.13,1.32±0.11和0.59±0.13,miR-34b组低于对照组,差异具有统计学意义(t=9.124,P<0.01);对照组、NC组和miR-34b组蛋白表达为1.81±0.18,1.79±0.14和1.29±0.16,miR-34b组低于对照组,差异具有统计学意义(t=8.227,P<0.01);裸鼠荷瘤实验表明过表达miR-34b裸鼠肿瘤生长曲线与对照组差异有统计学显著性意义,并且肿瘤体积显著低于对照组(t=8.184,P<0.01)。结论miR-34b可以促进人子宫内膜癌细胞的凋亡,抑制细胞迁移和侵袭能力,其机制与Jag1/Cyclin D1信号通路活性的抑制相关。