D3基因在抗病防卫反应中的转录调控研究

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight,BLB)是由水稻黄单胞菌属水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的细菌性病害,严重影响水稻产量。随着基因技术的发展,编辑抗病基因是提高水稻抗病性降低该病害的发生的一种行之有效的方法。本研究首先对D3基因编辑株系和野生型进行白叶枯病菌接种实验来确定D3基因对于白叶枯病菌的抗性,其次利用高通量测序技术对已筛选出的遗传纯合D3基因编辑株系进行转录组分析,同时结合基因差异表达分析、基因家族分析和富集分析挖掘其在抗病相关通路上的潜在作用,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分差异表达基因(differential expressed genes,DEGs)进行验证。结果表明:接种白叶枯病菌后D3基因被显著诱导,同时D3基因编辑株系均表现出不同程度的白叶枯病抗性。转录组数据显示,与野生型相比,在转录组水平共鉴定到8184个差异表达基因,包含4201个上调基因和3983个下调基因,3组均呈现差异表达的相关基因共有359个。GO功能富集分析表明,D3基因编辑株系与野生型在生物学途径、细胞组分和分子功能上的相关基因均呈显著差异表达。KEGG代谢途径富集分析发现,DEGs显著富集于植物与病原菌互作、植物激素信号转导以及苯丙烷生物合成途径。本研究丰富了水稻D3基因在抗病相关基因转录调控方面的信息,为D3基因抗病功能研究拓展了思路。

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoR I、Xba I双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoR I酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼24 hpf-72 hpf胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。

松材线虫cyp-33D3基因的RNA干扰及其功能研究

[目的]研究松材线虫cytochrome P45033D3(cyp-33D3)基因功能,为揭示松材线虫分子致病机制及其生物防治提供理论依据。[方法]采用双链RNA对cyp-33D3基因的表达进行干扰,测定该基因沉默后对松材线虫取食速率、个体大小、产卵数量、孵化率及致病力的影响。[结果]ddH2O和gfp dsRNA处理的线虫取食速度明显较快,在第5天已经几乎将灰葡萄孢菌丝取食殆尽,而cyp-33D3 dsRNA处理松材线虫取食灰葡萄孢的面积较小;cyp-33D3基因RNA干扰对松材线虫雌、雄成虫的体长无显著影响(P>0.05);与ddH2O和gfp dsRNA处理相比,cyp-33D3dsRNA处理每条雌虫平均产卵数量分别减低了12和11粒,虫卵孵化率分别减低了46%和43%;在接种40 d后,ddH2O处理的黑松苗发病率达到100%,cyp-33D3 dsRNA处理的黑松发病率为43.1%;而gfp dsRNA处理的黑松生长状况良好。[结论]cyp-33D3基因RNA干扰减缓了松材线虫的取食速度,减少了松材线虫的产卵数量,降低了松材线虫的虫卵孵化率和对黑松的致病力;松材线虫cyp-33D3基因RNA干扰对线虫的个体大小无明显影响。

DD3基因在前列腺癌诊断中的应用

前列腺癌（Prostatic cancer，PCa）是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤。据欧美国家男性泌尿外科文献报道，PCa的发病率居恶性肿瘤第二位，2005年新发现PCa患者232090例，死于PCa患者30350例。因此，PCa是50岁以上男性的第三位癌症死因。据统计，中国现在PCa的发病率比20世纪60年代增加50％以上。顾方六等统计前列腺癌在泌尿系肿瘤中发病率由3．3％上升至13．4％。

DRD3基因多态性与精神分裂症的相关性研究

目的 :研究多巴胺D3受体 (DRD3)基因的多态性与精神分裂症的关系。方法 :应用PCR -RFLP技术 ,在90名无亲缘关系的正常汉族人和80名精神分裂症患者中对DRD3基因第一外显子内Ser9Gly多态性进行分析。结果 :正常汉族人群中 ,DRD3等位基因1(Ser)和2(Gly)的频率分别为0.71和0.29。在正常对照组和精神分裂症组之间 ,等位基因频率 (X2=0.02,υ=1,P>0.05)和各种基因型 (P值均大于0.05)分布无显著性差异。结论 :DRD3基因的Ser9Gly多态性与中国汉族人群精神分裂症不相关。

强筋小麦龙麦26Glu-A3d基因遗传效应初步研究

龙麦26是东北春麦区强筋小麦育种的核心亲本,为进一步提高该品种品质潜力,拓宽其遗传基础,利用分子标记和6次选择性回交相结合的手段,将Glu-A3位点最优基因Glu-A3d导入龙麦26遗传背景之中,利用BC5F1、BC6F1群体和龙麦26的Glu-A3位点近等基因系为试材进行Glu-A3d基因遗传效应评价。结果表明,在强筋小麦品种龙麦26遗传背景下,导入Glu-A3d基因使籽粒蛋白、干面筋、面筋指数、吸水率、形成时间和稳定时间等指标3年平均分别提高0.07%、-2.13%、10.73%、0.13%、1.57%和4.97%。Zeleny沉降值和粉质仪的断裂时间2年平均分别提高3.05%和12.65%。以上结果表明,导入Glu-A3d基因使龙麦26品质性状均有不同程度提高。

原发性纤毛运动障碍家系PIH1D3基因的变异分析

目的探讨1个原发性纤毛运动障碍(primary ciliary dyskinesia,PCD)家系PIH1D3基因的变异及其基因型与表型的对应关系。方法对一例临床确诊的PCD患者进行家系分析,观察其鼻腔粘膜纤毛及精子鞭毛的超微结构,同时对患者的DNA样本进行全外显子组测序。结果患者及其家系患者均有不同程度的呼吸道感染史,2人具有内脏异位,表现为右位心,1例表现为不育。患者的纤毛及鞭毛结构存在异常,表现为内、外侧动力蛋白臂缺失,纤毛排列紊乱。DNA测序发现患者携带PIH1D3基因致病变异c.355C>T,该变异位于关键的PIH1结构域,所对应的氨基酸序列在人、猕猴、家犬、小鼠、爪蟾及斑马鱼中高度保守。结论PIH1D3基因的缺失可导致鼻腔纤毛及精子鞭毛中内、外侧动力蛋白臂组装失败、纤毛及精子无法正常游动等典型的PCD表型,临床可借助基因检测提高PCD的检出率。

人类特异性基因TBC1D3抑制M1型巨噬细胞极化减轻瘢痕增生的实验研究

目的探索TBC1D3基因对增生性瘢痕形成的影响及作用机制。方法分别在TBC1D3转基因小鼠和对照组小鼠背部制备增生性瘢痕模型;应用RT-PCR技术分别在术前、术后2周、术后4周时,检测转基因小鼠与对照组小鼠TBC1D3基因表达水平;分别于术后2周、4周时收集各组瘢痕标本,采用Masson染色观察瘢痕组织病理学改变并评分;流式细胞仪检测术后2周、4周时转基因小鼠与对照组小鼠外周血巨噬细胞表型。结果术前、术后转基因小鼠中TBC1D3基因均明显表达,而对照组未见表达。术后2周、4周,转基因小鼠的瘢痕组织病理学评分均较对照组显著降低(P<0.05);术后2周、4周,转基因小鼠外周血中M1型巨噬细胞比例较对照组小鼠均显著降低(P <0.05)。结论 TBC1D3基因可以有效抑制增生性瘢痕形成,其机制可能是通过抑制M1型巨噬细胞极化实现的。

UBE2D3基因过表达对食管癌细胞迁移增殖及顺铂敏感性的影响

目的 构建过表达人泛素交联酶UBE2D3基因的稳定转染食管癌EC109细胞株,并观察过表达后迁移增殖能力及对顺铂化疗敏感性的改变.方法 食管癌EC109细胞株分别转染pEGFP-C1和pEGFP-UBE2D3质粒后,分为阴性对照组（NC组）和过表达组（OE组）,并用G418进行筛选构建稳定转染细胞株.通过实时定量PCR（RT-PCR）法及Western blotting验证过表达效率,用划痕试验检测迁移能力,并用CCK-8法检测细胞增殖,半抑制浓度（IC50）法评价对顺铂的敏感性.结果 相对于亲本细胞,NC组UBE2D3 mRNA表达量为1.010±0.590,OE组为2.026±0.898;NC组UBE2D3蛋白表达量为0.923 ±0.237,OE组为1.520±0.487;NC组UBE2D3 mRNA及蛋白表达水平与空白对照组亲本细胞EC109相近（t=1.005,P＞0.05;t=1.492,P＞0.05）,OE组较亲本细胞组表达高（t=6.682,P＜0.05;t=9.150,P＜0.05）.在12 h NC组的迁移距离为（0.161±0.062） mm,OE组为（0.052±0.007） mm（=4.370,P＜0.05）;在24 h NC组的迁移距离为（0.309 ±0.071） mm,OE组为（0.074 ±0.012） mm（=3.644,P＜0.05）;在12 h和24 h时OE组相对于NC组的迁移率分别为0.236±0.051和0.241±0.037,OE组迁移能力明显较NC组降低;在第1天时OE组相对于NC组的增殖率为0.713±0.220（t=13.466,P＜0.05）,第2天为0.848±0.241（t =27.241,P＜0.05）,第3天为0.742 ±0.233（t=15.107,P＜0.05）.使用顺铂处理后,在第1天时OE组的IC50值相对于NC组为0.356±0.154（t =4.326,P＜0.05）,第2天为0.445±0.098（t =5.870,P＜0.05）,第3天为0.481±0.096（=5.009,P＜0.05）,OE组IC50值明显低于NC组;给予5μg/ml顺铂处理后,在第1、2、3天时OE和NC组相对于未使用顺铂处理时的增殖效率均减慢,其中OE组相对于NC组的增殖率分别为0.606±0.283（t=8.872,P＜0.05）、0.759±0.089（t=16.771,P＜0.05）和0.569±0.574（t =7.885,P＜0.05）,然而在第1、2、3天时OE组的存活率相对于NC组分别为0.831 ±0.323（t=24.226,P＜0.05）、0.875±0.102（t=33.541,P＜0.05）和0.853±0.359（t=28.187,P＜0.05）,顺铂对OE组抑制效率较NC组增加.结论 食管癌细胞EC109中过表达UBE2D3基因,能够抑制其迁移、增殖,增强其对顺铂的敏感性.

多巴胺D_3受体基因Ser9Gly多态性与阿立哌唑及利培酮治疗效应的关联研究

目的比较阿立哌唑与利培酮治疗女性首发精神分裂症患者的疗效和血浆催乳素水平变化及其与多巴胺D3受体(DRD3)基因Ser9Gly(rs6280)多态性的关联。方法选择完成8周阿立哌唑或利培酮治疗的女性首发精神分裂症患者各60例,于治疗前和治疗8周后分别评测阳性与阴性症状量表(positive and negativesymptom scale,PANSS)。采用放射免疫法检测血浆催乳素水平,DNA测序技术检测DRD3基因Ser9Gly多态性,分析DRD3基因Ser9Gly多态性与两药疗效及血浆催乳素变化的关联。结果治疗8周后,两组PANSS减分率的差异无统计学意义[(59.79±23.48)vs.(63.30±22.66),P>0.05],但利培酮组血浆催乳素的变化值高于阿立哌唑组[(26.92±9.48)vs.(-25.25±8.07),P<0.05]。利培酮组中C等位基因携带者的血浆催乳素的增加明显高于未携带者[(52.48±27.01)ng/mL vs(36.07±17.46),P<0.05];而阿立哌唑组中未见此差异[(-23.27±8.36)vs.TT(-26.05±8.11),P>0.05]。两组8周后PANSS减分率(%)与DRD3基因Ser9Gly的差异均无统计学意义:阿立哌唑组[CC+CT(57.83±19.94)vs.TT(56.84±18.46),P>0.05];利培酮组[CC+CT(53.94±21.08)vs.TT(60.38±19.37),P>0.05]。结论阿立哌唑治疗女性首发精神分裂症疗效与利培酮相当,但引起血浆催乳素水平变化的幅度较小;利培酮引起血浆催乳素水平增加可能与DRD3基因Ser9Gly多态性有关联。

2012年猪嵴病毒流行病学调查及3D基因的遗传变异分析

为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3D基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3D基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3D基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3D基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3D基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物,用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(DE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48kD、68kD,并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了3D基因片段,将pMD18_3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及XbaⅠ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac_3D;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid_3D;将Bacmid_3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测。经SDS_PAGE和West ernblot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达。

猪嵴病毒福建株3D基因的克隆及遗传进化分析

根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3D基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3D基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3D开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3D基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3D基因序列进行分析比较,该毒株的3D基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

绵羊Dlx3基因启动子活性及其多态性与羊毛品质性状的关联

【目的】通过开展绵羊Dlx3基因启动子结构、活性、多态性及其与羊毛品质性状的关联等分析,揭示Dlx3基因在绵羊毛囊发育中的作用及其作用机制。【方法】采用PCR扩增Dlx3基因起始密码子上游1.5 kb区域,利用荧光素酶报告基因技术分析Dlx3基因启动子活性,采用测序方法寻找Dlx3基因启动子区SNP,并利用PCR-RFLP技术进行SNP分型。【结果】①Dlx3基因启动子近端序列的保守性较高,该区域内人、鼠及绵羊都具有23个保守的转录因子结合位点和一个CpG岛,而启动子的远端序列的保守性较低;②Dlx3基因的启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中具有启动子活性;③Dlx3基因启动子的-1 551—-1 108 bp与-1 108—-707 bp区域对启动子活性影响较大;④Dlx3基因启动子区SNP位点(G-1166A)多态性与羊毛卷曲度显著相关。【结论】①Dlx3基因启动子在绵羊胚胎成纤维细胞中有活性;②Dlx3基因启动子的近端序列组成在人、鼠和绵羊中较为保守,而其远端序列的保守性较低,但是Dlx3基因启动子的远端序列对启动子活性影响较大;③Dlx3基因启动子区G-1166A位点是羊毛卷曲度的一个分子标记。

口蹄疫病毒3D基因的克隆及其编码蛋白的结构和功能预测

采用RT-PCR技术,对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的3D基因进行克隆,并对其序列进行比对,同时利用Ex-pasy等生物软件对3D蛋白的二级、三级结构及生物学特性进行预测和分析.结果表明:3D蛋白在口蹄疫各血清型间高度保守,分子中含有一个糖基化位点及多个酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸位点,并存在一个单股正链RNA病毒依赖RNA多聚酶的催化区;结构特点显示3D蛋白为口蹄疫病毒复制所需的多聚酶.

多巴胺D3受体基因Ser9Gly多态性与抑郁症的相关研究

目的 探讨多巴胺D3受体基因（D3R基因）Ser9Gly多态性在抑郁症发病机制中的作用.方法 选取50例抑郁症患者作为抑郁症组,另外选取30例健康体检者作为对照组.采集全血标本,提取模板DNA,特定引物扩增D3R基因片断,用限制性内切酶Mls Ⅰ（Bal Ⅰ）进行酶切,鉴定基因型.所有结果数据均采用SigmaStat统计分析软件包进行统计分析.结果 抑郁症组与对照组之间D3R基因Ser9Gly多态性位点等位基因频率、基因型分布之间差异无统计学意义（P〉0.05）.抑郁症患者D3R基因Ser9Gly多态性基因型分布频率为：Ser/Ser 40%,Ser/Gly 46%,Gly/Gly 14%.D3R基因Ser9Gly多态性位点基因型分布的两两比较显示：Ser/Ser与Ser/Gly、Ser/Ser与Gly/Gly、Ser/Gly与Gly/Gly之间的差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论 抑郁症患者的D3R基因Ser9Gly多态性与抑郁症的发病无相关性.

口蹄疫病毒P12X3C3D多基因编码蛋白在昆虫细胞中的表达与检测

利用杆状病毒表达系统构建了包含有口蹄疫病毒(FMDV)P12X3C3D多基因片段的重组杆状病毒。将该病毒感染Sf9细胞后,利用SDS-PAGE及夹心ELISA方法检测目的蛋白的表达。结果表明,重组杆状病毒能够表达FMDV目的蛋白,该表达产物能被FMDV阳性血清识别,具有一定的反应原性。

核糖体28S-D3等位基因特异扩增鉴别微小按蚊亲缘种A和C

目的 建立微小按蚊复合体不同亲缘种A和C的分子鉴别方法。方法 用单蚊蚊腿消化提取基因组DNA ,PCR特异扩增 2 8S第 3结构域 (D3 )基因 ,对PCR产物进行纯化、克隆、测序和序列分析 ;基于序列差异设计特异引物 ,进行等位基因特异扩增 (PCR -ASA) ,根据扩增片段大小区分微小按蚊不同亲缘种。结果 发现微小按蚊不同亲缘种A和C(GeneBank登录号 :AF416782 ,AF42 5 5 94) ,根据二者序列差异设计的特异引物能在普通琼脂糖凝胶上直观地区分两亲缘种 ,两者除在 3 76bp处有一共同条带外 ,分别在 2 94bp和 112bp处出现各自的特异扩增带。结论 我们建立的ASA分子鉴别方法能有效地将我国微小按蚊不同亲缘种A和C区分开来。

羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达

本研究通过构建含有3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组杆状病毒,旨在通过昆虫细胞表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较奠定了基础。将细粒棘球蚴EG95s基因与3拷贝羊C3d基因串联,插入pTarget载体,获得重组质粒pTarget-EG95-(C3d)3,利用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切位点将目的基因EG95-(C3d)3克隆至Bac-to-Bac系统的转移载体pFastBac-Hta中,获得pFastBacHta-EG95-(C3d)3重组质粒,将该重组质粒转化含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中进行转座重组,获得携带3拷贝羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因的重组转座子rBacmid-EG95-(C3d)3,转染Sf9昆虫细胞后获得EG95-(C3d)3重组杆状病毒,并表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行重组蛋白的鉴定。同时利用昆虫细胞表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体进行检测。结果表明,获得了EG95-(C3d)3重组杆状病毒,且EG95-(C3d)3重组融合蛋白在Sf9昆虫细胞得到了正确表达,大小约为132ku,Western blotting鉴定结果显示表达的EG95-(C3d)3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明EG95-(C3d)3基因表达产物具有免疫活性。同时表达蛋白对羊棘球蚴病特异性抗体有良好的敏感性。EG95-(C3d)3基因在昆虫细胞获得表达,为原核表达和真核表达EG95-(C3d)3重组融合蛋白的免疫效果的比较,及细粒棘球蚴病的高效检测方法的建立奠定了基础。