D-Ala对转染DAAO基因的K562e细胞移植瘤的杀伤效应

以高致瘤性K5 6 2e细胞和表达DAAO基因的KDfGC细胞建立裸鼠移植瘤模型 ,D 丙氨酸 (D Ala)腹腔注射 ,持续 3周 ,观察D Ala对移植瘤的治疗作用以及肿瘤、裸鼠重要脏器的病理变化。结果显示 ,经D Ala治疗 ,转基因肿瘤抑制率为 5 3 8% ,未转基因肿瘤抑制率为 0 3%。治疗组KDfGC细胞瘤体出现围绕血管分布的坏死。心、肝、肾治疗组与对照组均无明显病理改变。说明在体内DAAO+的K5 6 2e能被D Ala有效杀伤 。

丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究

目的:研究了丁胱亚磺酰亚胺(BSO)增强D-氨基酸氧化酶(DAAO)/D-丙氨酸(D-Ala)自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用。方法:应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞K_(DIGC),用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的K_(DfGC)进行鉴定。应用MTT法检测D-Ala对BSO预处理过的K_(DfGC)细胞的杀伤作用。结果:PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中,并在mRNA水平上表达。D-Ala作用24h,K_(DfGC)细胞的半数抑制浓度(C_(50))为10.21mmol/L,K_(DfGC)+BSO的IC_(50)为7.92mmol/L,两者的95％可信区间不重叠。结论:BSO可增强DAAO/D-Ala系统杀伤K652e细胞作用。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

D-氨基酸氧化酶基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的 :构建含D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因的重组逆转录病毒载体 ,初步观察DAAO基因的功能。方法 :利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体 (pLDAAOSN)中 ,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,将重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,观察 5 0mm/LD 丙氨酸对KDAAO杀伤作用。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证明重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6CFU/ml)。PCR、原位杂交分析证明DAAO基因已整合至KDAAO基因组中 ,并在mRNA水平表达。初步观察到D 丙氨酸能明显杀伤KDAAO。结论

过氧化氢对D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸反应的影响

在D-氨基酸氧化酶D1AAO转化头孢菌素C(CPC)为戊二酰基-7-氨基头孢烯酸(Gl-7-ACA)的反应中,所生成的过氧化氢同时与CPC和Gl-7-ACA发生的氧化副反应是造成目标产物收率损失的关键因素之一。通过联用溶氧电极和过氧化氢电极,测定了DAAO转化CPC为Gl-7-ACA的反应体系内溶氧浓度与相应的过氧化氢浓度的变化曲线,测知反应体系中过氧化氢浓度积累最高可达5mmol·L-1。模拟该反应条件下过氧化氢的氧化反应可知,在过氧化氢浓度较低时,溶液的酸性可加速该氧化反应。在中性条件下,过氧化氢浓度为5mmol·L-1时,反应1h后,CPC的氧化损失为2%,Gl-7-ACA的氧化损失为3%。通过改进氧气分布器、搅拌转速和并调控氧气流量以控制溶液中溶解氧的浓度,来适度地降低物系中过氧化氢积累浓度,使反应收率提高了2.2%。

变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因的克隆与表达

参照GenBank中D—氨基酸氧化酶基因序列设计引物,利用跨内含子PCR技术从变异三角酵母(Trigonopsis variabilis)基因组中扩增D—氨基酸氧化酶基因编码区序列。将DAAO基因用NcoⅠ和HindⅢ双酶切后,与经相同酶切的大肠杆菌表达载体pET-28a连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达变异三角酵母D—氨基酸氧化酶的工程菌株BL21(DE3)/pET-28a-DAAO。测序结果表明所克隆的基因序列与GenBank中变异三角酵母D—氨基酸氧化酶基因序列同源性达99%以上。SDS-PAGE分析及酶活测定表明所构建的工程菌能高效表达D—氨基酸氧化酶,且表达产物有较高酶活力。

不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节

目的构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究。方法采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化。结果获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut+的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basalsalts培养基内,当生长时间为36h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达。在菌体密度相同的条件下,Mut+表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加。结论Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵。

D-丝氨酸调节NMDA受体在偏头痛及其相关疾病中的研究进展

D-丝氨酸由丝氨酸消旋酶(Serine racemase,Srr)催化L-丝氨酸生成,由D型氨基酸氧化酶(D-amino-acid oxidase,DAAO)催化降解,是谷氨酸能系统的重要神经递质。D-丝氨酸与N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体的甘氨酸位点结合,与激动剂共同激活NMDA受体。偏头痛是一种反复发作的原发性头痛,在影响人类生活质量的同时也给社会造成了巨大负担。多项研究证实,NMDA受体激活在偏头痛发生发展中发挥重要作用。目前,D-丝氨酸调节NMDA受体在偏头痛中的作用机制尚无具体研究,但其在偏头痛相关疾病如神经病理性疼痛、抑郁、双相障碍、癫痫、精神分裂症中却有不同程度的研究。本文将通过总结D-丝氨酸在偏头痛相关疾病中的研究进展得出一定规律,从而为D-丝氨酸在偏头痛中的研究提供新的思路。

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达,分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO(TvDAAO)的N-端融合蛋白。其中,MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时,目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右,比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍;但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时,DAAO酶活达到了3.24u/mL,比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。

绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D

D型氨基酸氧化酶活性对于D-硝基精氨酸手性转化的影响

D-硝基精氨酸(D-NNA)可在大鼠体内发生手性转化生成其L型异构体,即L-NNA,后者可抑制一氧化氮合酶活性,减少一氧化氮生成,升高动脉血压.研究了D型氨基酸氧化酶(DAAO)在D-NNA手性转化中的作用及DAAO对不同(包括已报道在体内可发生手型转化的)D型氨基酸的选择活性.体内实验显示,DAAO的选择性抑制剂苯甲酸钠(400mg/kg)或肌酐(400mg/kg)均可在不同程度上抑制D-NNA升压作用,进一步研究发现,肾脏或肝脏DAAO酶液在外加DAAO后可提高D-NNA的手性转化约2倍,表明DAAO对于D-NNA在体内的手性转化是必需的.DAAO酶液对可在体内发生手性转化且转化率相似(30%～50%)的D型氨基酸(D-Phe,D-Leu和D-NNA)的选择性表现出显著差异(Kcat/Km相差可达约15倍左右),这从另一方面表明体内D-硝基精氨酸氧化是其发生手性转化的前提条件但非决定因素.

应用固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为7-ACA

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是两步酶法催化头孢菌素C(CPC)生成7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的重要酶之一。利用固定化DAAO催化CPC的转化液中,酮酸中间体随批次的增加逐渐减少,反应至第13批时,转化基本完全。当转化液pH由7.2升至7.6时,终止反应,转化率和收率分别达99.6%和93%。分次补加固定化DAAO,可连续转化132批。

六横大岙附近海域环境质量现状评价

根据１９９５年４月对码头工程区附近海域的水质和沉积物的环境质量现场调查，采用环境质量指数法，评价了该海区水质和沉积物的环境质量状况。结果表明，水质中无机氮严重超标，超三类标准的超标率达１００％。无机磷超一类标准的超标率达１００％，有个别测站超二类标准。ＣＯＤ、ｐＨ、ＤＯ、油类均低于一类海水标准。潮间带水质基本符合一类水质要求。

DNP法测定D-氨基酸氧化酶活力

半合成头孢菌素由于其在临床上卓苦的疗效而愈来愈引人注目。大多数的半合成头孢菌素都以7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)作母核。长期来,7-ACA是由发酵产物头孢菌素C(CPC)经化学方法裂解制得。但由于化学裂解法存在着成本高,三废污染等问题,二十余年来,国内外在探索采用酶法制备7-ACA的可能性。尤其是近年来生化工程的迅速发展,酶法裂解CPC制备7-ACA,越来越为研究者所重视。由于CPC7位侧链中D-α氨基的立体障碍,由CPC通过一步酶法裂解制备7-ACA较困难,而研究较多的是利用酶法或化学法先将侧链氨基进行氧化后再通过酰化酶的水解制得7-ACA。

基于大坳灌区扩建地下水环境影响评价

依据大坳灌区水文地质、气象、灌溉、开采、地下水动态监测等方面的资料,在掌握灌区地下水水位动态变化机理及动态特征的基础上,建立了区域的水文地质概念模型。运用地下水数值模拟软件Groundwater Model System建立灌区地下水水流模型,对灌区地下水水位进行模拟。模拟结果表明:地下水位的计算值和实测值吻合较好,该模型可以用来对该灌区新渠系建设后的地下水位进行预测。模型预测结果为:灌区新渠投入运行多年后地下水水位大部分上升值小于0.2 m,最大上升值0.49 m,对区域地下水位总体影响不大,不会引起相应的生态环境问题。

绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

目的 :探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点 (IRES)序列连接的绿荧光蛋白 (GFP)的荧光强度为单位 ,衡量D 氨基酸氧化酶 (DAAO)活性的准确性。 方法 :白血病细胞系K5 62e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG ,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。 结果 :KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .64%和 96.3 1%。 2× 10 4细胞的平均荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。 2× 10 4细胞的蛋白量分别为 13 .17μg和 7.12 μg ,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2 O2 峰值无差异 ,而以单位荧光来衡量 ,两细胞具有明显差别。 结论 :在含IRES序列的转基因细胞 ,以GFP的平均荧光强度为度量单位 ,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性。

大坳面板坝初期蓄水原型观测资料分析

采用了软岩料填筑堆石主体的大坳面板坝蓄水后各方面的原型观测资料反映其运行正常

大坳混凝土面板堆石坝工程设计及技术特点

大坳混凝土面板堆石坝最大坝高 90 2m ,利用软岩料填筑大坝主体 ,现成功运行 全面介绍了大坝体形、面板、趾板、分缝止水、基础处理。

将最新的科学研究转化药理学教学实验的尝试

在进行药理学实验教学改革的探索中,我们尝试将最新的科学研究转化为药理学实验教学,取得了较好的教学效果。我们将新发现的慢性疼痛靶点分子D-型氨基酸氧化酶(DAAO)抑制剂苯甲酸钠引入药物镇痛实验;将新型降糖药GLP-1类似物exenatide及新型抗高血糖靶点分子钠-葡萄糖2型转运体(SGLT2)的特异性抑制剂dapagliflozin引入降血糖药物实验,不但丰富了原实验内容,加强了学生对所学知识的融汇贯通,而且拉近了前沿科学研究与学生的距离,使他们直接了解和感受到一个新的药物靶点的发现对新药研发所产生的巨大影响,非常有助于对学生科学创新精神的培养。