D-Ala对转染DAAO基因的K562e细胞移植瘤的杀伤效应

以高致瘤性K5 6 2e细胞和表达DAAO基因的KDfGC细胞建立裸鼠移植瘤模型 ,D 丙氨酸 (D Ala)腹腔注射 ,持续 3周 ,观察D Ala对移植瘤的治疗作用以及肿瘤、裸鼠重要脏器的病理变化。结果显示 ,经D Ala治疗 ,转基因肿瘤抑制率为 5 3 8% ,未转基因肿瘤抑制率为 0 3%。治疗组KDfGC细胞瘤体出现围绕血管分布的坏死。心、肝、肾治疗组与对照组均无明显病理改变。说明在体内DAAO+的K5 6 2e能被D Ala有效杀伤 。

丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究

目的:研究了丁胱亚磺酰亚胺(BSO)增强D-氨基酸氧化酶(DAAO)/D-丙氨酸(D-Ala)自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用。方法:应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞K_(DIGC),用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的K_(DfGC)进行鉴定。应用MTT法检测D-Ala对BSO预处理过的K_(DfGC)细胞的杀伤作用。结果:PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中,并在mRNA水平上表达。D-Ala作用24h,K_(DfGC)细胞的半数抑制浓度(C_(50))为10.21mmol/L,K_(DfGC)+BSO的IC_(50)为7.92mmol/L,两者的95％可信区间不重叠。结论:BSO可增强DAAO/D-Ala系统杀伤K652e细胞作用。

绿色荧光蛋白标记的D氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究(英文)

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在人宫颈癌细胞 (HeLa细胞 )中的表达及其功能 ,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框 (ORF)的真核表达载体 pIRES DAAO。脂质体法转染HeLa细胞 ,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达 ,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞 ,命名为HeLa D。以不同浓度的前药D Ala处理HeLa D细胞 ,MTT法检测细胞存活率。结果显示 ,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa D细胞中表达 ,流式细胞术成功筛选出HeLa D细胞。前药D Ala能明显杀伤HeLa D细胞。结果表明 ,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞 ,DAAO/D

D-氨基酸氧化酶基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的 :构建含D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因的重组逆转录病毒载体 ,初步观察DAAO基因的功能。方法 :利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体 (pLDAAOSN)中 ,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,将重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,观察 5 0mm/LD 丙氨酸对KDAAO杀伤作用。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证明重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6CFU/ml)。PCR、原位杂交分析证明DAAO基因已整合至KDAAO基因组中 ,并在mRNA水平表达。初步观察到D 丙氨酸能明显杀伤KDAAO。结论

绿荧光蛋白的荧光强度在D-氨基酸氧化酶活性检测中的应用

目的 :探讨在转基因细胞KDfGc和KDfGd,以内部核糖体进入位点 (IRES)序列连接的绿荧光蛋白 (GFP)的荧光强度为单位 ,衡量D 氨基酸氧化酶 (DAAO)活性的准确性。 方法 :白血病细胞系K5 62e经转染含IRES序列连接的GFP和DAAO基因的逆转录病毒载体pLDfG ,获得稳定表达GFP和DAAO基因的单克隆细胞KDfGc和KDfGd,以流式细胞仪和Lowry测定其荧光阳性率以及平均荧光强度、蛋白量 ,用D 丙氨酸 (D Ala)作用DAAO+细胞 ,并用酚红氧化法测定培养上清H2 O2 。 结果 :KDfGc和KDfGd细胞的荧光阳性率分别为 94 .64%和 96.3 1%。 2× 10 4细胞的平均荧光强度分别为 2 0 2U和 174U。 2× 10 4细胞的蛋白量分别为 13 .17μg和 7.12 μg ,KDfGc、KDfGd细胞每微克蛋白量每小时产生的H2 O2 峰值无差异 ,而以单位荧光来衡量 ,两细胞具有明显差别。 结论 :在含IRES序列的转基因细胞 ,以GFP的平均荧光强度为度量单位 ,比以细胞蛋白量能更准确地反映DAAO的活性。

D-氨基酸氧化酶基因在K562细胞中的表达及其介导的细胞毒性作用的研究

目的 探讨逆转录病毒介导的红色酵母D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因在K5 6 2细胞中的表达及其功能。方法 将DAAOcDNA克隆至逆转录病毒载体pLSN中 ,构建了载体pLDAAOSN ,经ΦNXA细胞包装后 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,以重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO 。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,并以不同浓度的D 丙氨酸 (D Ala)处理KDAAO 细胞。结果 重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6cfu ml)。DAAO基因已整合至KDAAO细胞基因组中 ,并在mRNA水平表达。D Ala能明显杀伤KDAAO 细胞。结论 DAAO D Ala自杀基因系统可以进一步用于肿瘤的基因治疗研究。