HPLC-DAD法测定草鱼肉质中的维生素B_(1)和维生素B_(12)的含量

本文建立了高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)同时分离检测草鱼肉质中维生素B_(1)和维生素B_(12)的方法。草鱼样品经过酸消化和酶提取后释放出样品中蛋白结合和磷酸化的维生素B_(1)和维生素B_(12),再经固相萃取净化,结合HPLC-DAD对两种目标物进行检测。考察了高效液相色谱条件中流动相组成对分离效果的影响及固相萃取条件中样品溶液pH和洗脱剂对样品回收率的影响。采用HLB固相萃取柱对草鱼样品进行净化,甲醇/水(v/v=1/1)混合液洗脱维生素B_(1)和维生素B_(12)。色谱流动相分别为85%甲醇和50 mmol/L磷酸二氢钠(pH 3.00,含5 mmol/L己烷磺酸),进行梯度洗脱,柱温为40℃,检测波长为255 nm,进样体积为20µL,维生素B_(1)和B_(12)可在15 min内分离。在最佳分离检测条件下,维生素B_(1)和B_(12)的检出限(S/N=3)为0.21~0.36µg/mL,加标回收率为83.9%~95.1%。本文建立的方法可对草鱼肉质中维生素B_(1)和维生素B_(12)含量进行准确定量。

杂色鲍DAD1的克隆及在发育、弧菌感染、高温和缺氧下的表达分析

抗细胞凋亡因子(DAD1)是细胞凋亡的负调控因子。在杂色鲍转录组测序的基础上,通过RACE的方法,获得了杂色鲍DAD1基因的全长c DNA,命名为HdDAD1。该序列全长553 bp,开放阅读框339 bp,编码112个氨基酸。编码蛋白具有保守的DAD功能域和3段跨膜区。实时定量PCR结果表明,HdDAD1在杂色鲍所检测组织中均有表达,消化道、鳃、血细胞、粘液腺和肾脏中表达量最高。同样,HdDAD1在发育各阶段均有表达,幼虫阶段表达量最高,原肠胚次之,其他胚胎发育阶段和稚鲍表达量最低。HdDAD1能够响应细菌感染、高温和缺氧应激。在弧菌注射12 h后,表达量显著上升。当水温由最适的25°C上升到28°C时,HdDAD1表达量升高;在31°C持续4和96 h时HdDAD1表达量显著上升。在低氧处理4和96 h时,HdDAD1的表达量也显著上升。

抗细胞凋亡因子DAD1的研究进展

抗细胞凋亡因子(defender against cell death 1,DAD1)是定位于内质网膜上的寡糖基转移酶(OST)的一个亚基,它维持OST复合物的结构完整性,并参与对蛋白质的N-糖基化修饰。该基因最早从对温度敏感的仓鼠肾源性细胞株(tsBN7)的突变株中克隆,并发现具有抑制凋亡的功能。大量研究显示,DAD1基因表达于不同物种中,是高度保守的基因,其除了抗凋亡作用,还显示出促进细胞增殖方面的新作用。本文主要介绍DAD1的结构和功能研究进展,展望DAD1的研究前景和发展方向。

脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的克隆及其组织表达分析

取健康脊尾白虾（Exopalaemoncarinicauda）成体，体长（5．81±0．32）cm，体质量（1．18±0．35）g。根据本实验室已构建的脊尾白虾血细胞全长CDNA文库进行EST测序分析，获得脊尾白虾抗细胞凋亡因子DADl基因的cDNA全长并命名为EcDADl基因。该序列全长645bp，包括5非编码区184bp，开放阅读框345bp和3非编码区116bp，共编码114个氨基酸，预测分子量为12．85kD，理论等电点为8．75。同源性分析表明，脊尾白虾抗细胞凋亡因子EcDAD1氨基酸序列与其他物种DAD1有高度同源性，与斑节对虾（Penaeusmonodon）的相似性最高，为92％；与其他无脊椎动物的相似性为73％～80％。系统进化分析表明，脊尾白虾EcDAD1与斑节对虾的DAD1紧密聚为一支。荧光定量PCR分析结果表明，EcDAD1基因在脊尾白虾血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃和眼柄中均有表达，其中卵巢中的相对表达量最高。感染鳗弧菌（Vibrioanguillarum）和WSSV后6h和12h，脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcDAD1的表达量较对照组均显著增加（P〈0．01），且不同时间点间差异显著，表明EcDAD1基因可能在脊尾白虾抵抗病原体入侵机体的过程中具有重要作用。

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.

Sj Dad1反义核酸抗日本血吸虫感染的实验研究

目的 进一步鉴定已获得的日本血吸虫新基因 Ｓｊ Ｄａｄ１的功能。方法 构建Ｓｊ Ｄａｄ１反义（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）核酸载体ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１和正义（ｓｅｎｓｅ）核酸载体 ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄｅｄ１．ＢＡＬＢ／ｃ小鼠感染日本血吸虫尾蚴后第 ３天，通过小鼠尾静脉分别注射ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）、空载体和生理盐水。４５ｄ后解剖实验小鼠进行保护性效果评价。结果 在ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）组、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）组以及ｐＥＧＦＰ－Ｎ３组小鼠肺部冰冻切片检查发现在童虫周围有绿色荧光出现，而在生理盐水组则无此现象。但各实验组保护性效果无统计学差异（Ｐ＞ ０．０５）。结论Ｓｊ Ｄａｄ１反义核酸无明显的抗日本血吸虫感染的效果，尚需寻找其它方法对 Ｓｊ Ｄａｄ１的疫苗候选基因价值作进一步的鉴定。

DADS诱导人胃癌细胞分化作用中ERK/AP-1通路的改变

目的 探讨ERK/AP 1通路在二烯丙基二硫 (DADS)诱导人胃癌细胞分化中的作用 ,阐明DADS诱导人胃癌细胞分化的分子机制。方法 采用免疫细胞化学、图像分析及WesternBlot等方法 ,观察DADS作用于体外培养的人胃癌MGC80 3细胞前后AP 1成员c fos与c jun表达的改变以及ERKMAPK激酶的变化。结果 免疫细胞化学及图像分析结果显示 ,对照组c fos、c jun表达呈强阳性 ,而处理组呈阴性或弱阳性 ,阳性率明显降低 ,处理组光密度值较对照组明显低 (P <0 0 5 )。WesternBlot结果显示 :从 2 0、2 5、30到 35mg·L-1DADS处理癌细胞 ,DADS呈浓度依赖性抑制人胃癌细胞中ERK的活化 (P <0 0 5 ) ;并且DADS +MEK抑制剂PD980 5 9能完全阻断ERK活化 (P <0 0 5 ) ;时间效应上 ,在DADS刺激后 15～ 30min抑制作用最强 ,2h左右恢复至接近正常 (P <0 0 5 )。结论 ERK/AP

超级稻DAD1基因正反义植物表达载体的构建及转化菊花的研究

将水稻DAD1基因插入Ti质粒,构建成该基因的正反义植物表达载体pWM-DAD1,pWM-antisense DAD1,转入根癌农杆菌LBA4404后,利用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经Hyg抗性筛选,并诱导愈伤组织和分化成苗,得到转基因菊花植株,通过PCR检测,从部分转基因植株中检测出预期的目的基因的存在.

白菜型油菜BrDAD1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了白菜型油菜BrDAD1基因及自身的启动子基因Pro-DAD1,并将其分别克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因及启动子全序列。结果表明,该基因及启动子全长分别为1 270 bp与1 335 bp。将白菜型油菜BrDAD1基因反向克隆到植物表达载体pCambia 1300的自身启动子基因Pro-DAD1启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体pCamDAD1。

水稻程序性细胞死亡抑制基因Dad-1在薏苡中的定位

基因Dad-1是普遍存在于动物和植物中一个高度保守的程序性细胞死亡抑制基因。以水稻Dad-1基因为探针,采用Southern杂交在薏苡中检出了Dad-1基因的同源序列,并利用荧光原位杂交的方法对其进行了染色体物理定位。在薏苡第9染色体短臂上检测到Dad-1基因的杂交信号,信号与着丝粒的百分距离为67.44±1.45。

英红1号、英红9号和祁门茶树芽叶中嘌呤生物碱和茶多酚的HPLC-DAD-MS／MS分析

采用HPLC-DAD-MS/MS技术对英红1号、英红9号和祁门茶树的芽叶进行了分析,鉴定出了2种嘌呤生物碱,7种儿茶素类化合物以及2种非儿茶素类茶多酚。对这3个茶树品种的嘌呤生物碱和儿茶素类成分质量分数进行比较分析,结果表明三者的儿茶素类总质量分数均大于20%,其中英红1号和祁门红茶品种在儿茶素类成分的组成上较为接近,EGCG质量分数均为最高;而英红9号质量分数最高的是ECG。

DADS对TE-1体外以及裸鼠体内生长的影响及作用机制

目的探讨二烯丙基二硫化物(DADS)对TE-1细胞体外以及裸鼠体内生长的影响及其作用机制。方法 MTT法检测24 h、48 h不同浓度DADS体外对食管癌TE-1细胞活力的影响。使用TE-1细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组和DADS低浓度治疗组(20 mg/kg)、DADS高浓度治疗组(40 mg/kg),腹腔注射14次,隔日1次,观察动物状态并监测移植瘤生长状况,28 d后处死动物,使用Western blot检测不同组别移植瘤中磷酸化p38、磷酸化ERK1/2、caspase-3、活化caspase-3的表达水平。结果 MTT结果提示DADS能够在体外抑制TE-1的增殖,且具有剂量依赖性。DADS药物治疗组移植瘤生长速度明显低于对照组,以高剂量组为著。Western blot检测结果显示,DADS药物组移植瘤中p38MAPK磷酸化水平升高、ERK1/2的磷酸化水平显著降低,活化caspase-3水平明显升高,且均呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 DADS在裸鼠体外、体内均能显著抑制人食管癌TE-1细胞的生长,其作用机制可能与DADS活化p38MAPK通路并抑制ERK通路,活化caspase-3进而抑制肿瘤增殖并促进TE-1细胞凋亡有关。

HPLC-DAD法检测桑叶中的1-脱氧野尻霉素

本实验旨在建立检测桑叶中1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的高效液相色谱(HPLC)-二极管阵列检测器(DAD)方法。以0.05mol/LHCl为提取溶剂,芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)为衍生剂,在pH8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应,生成具有紫外吸收的1-DNJ-FMOC络合物,采用C18色谱柱,乙腈和水为流动相,最大吸收波长为265nm处对目标物进行检测。结果表明:1-DNJ的色谱图分离效果良好,线性相关系数为0.9997,检出限为0.015mg/mL。样品平均加标回收率为81.3%~92.1%,相对标准偏差(RSDs)为4.7%~6.5%(n=5)。

桂花DAD-1基因克隆与表达分析

以"柳叶金桂"桂花(Osmanthus fragrans‘Liuye Jingui’)为试材,采用TAIL-PCR技术,克隆了"柳叶金桂"花瓣中DAD-1基因的全长序列,并分析了其在桂花不同组织部位及开花阶段的时空表达模式,以期为研究该基因在桂花花瓣衰老过程中的功能提供参考依据。结果表明:DAD-1基因由560个碱基组成,包含一个351bp的完整开放阅读框和一个3′-Poly A尾巴;DAD-1基因编码的蛋白包含116个氨基酸,其结构预测表明DAD-1蛋白属于疏水性膜整合蛋白,通过3个α?螺旋构成的跨膜区行使功能。半定量PCR结果表明,该基因在"柳叶金桂"的根、茎、叶、花等各组织器官中均有表达,且在花苞、新叶等幼嫩组织器官中相对表达量较高,在老叶等成熟组织器官中相对表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在"柳叶金桂"花瓣衰老过程中,DAD-1基因在铃梗期开始显著下调表达。

利用瞬时表达技术分析小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能

利用小麦离体叶片瞬时表达技术分析了3个小麦抗白粉病相关基因CAF1、BI-1和DAD1的功能。根据小麦响应白粉菌侵染的差异表达基因芯片检测结果,筛选出表达差异的抗病相关基因CAF1和BI-1,并挑选与植物程序性死亡相关的基因DAD1,将克隆到的这3个小麦基因全长ORF序列构建入超表达载体pAHC25中,利用瞬时表达技术检测目标基因和GUS基因共转化的阳性小麦叶片表皮细胞中白粉菌成功侵入并形成吸器的细胞比例(侵入频率),研究目标基因的超表达后对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明,小麦CAF1基因在感病小麦品种叶片中的瞬时表达,对白粉病侵入和吸器形成具有一定的抑制作用(侵入频率为(37.37±3.2)%,对照为(54.75±0.6)%),在一定程度上增强了表达细胞对白粉菌的抗性;表达DAD1基因则可能在一定程度上有利于白粉菌吸器的形成(侵入频率为(57.34±1.1)%,对照为(50.93±1.3)%);而在感病叶片中表达基因BI-1对白粉菌吸器形成没有明显影响(侵入频率为(54.31±1.7)%,对照为(52.37±1.8)%)。

siRNA-DAD1联合人参皂苷Rh2对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨基因沉默DAD1联合人参皂苷Rh2对肝癌细胞增殖和凋亡的作用机制。方法化学合成siRNADAD1,然后转染肝癌SMMC-7721细胞,分别采用Q-PCR和Western blot检测DAD1的mRNA及蛋白表达水平变化,CCK-8法检测肝癌SMMC-7721细胞增殖能力的改变,DNA Ladder法和流式细胞术检测肝癌SMMC-7721细胞凋亡的变化。结果 siRNA-DAD1可下调肝癌SMMC-7721细胞中DAD1的mRNA及蛋白表达水平;siRNA-DAD1与人参皂苷Rh2均具有抑制SMMC-7721细胞增殖的能力,并促使其发生凋亡,二者联合作用效果更好(P<0.05)。结论 siRNADAD1可下调肝癌SMMC-7721细胞中DAD1的mRNA和蛋白表达水平,与人参皂苷Rh2协同抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖并促进其凋亡。

新疆雪莲DAD1基因提高烟草的抗旱性与抗盐性

利用已构建好的pCMB IA 2301-35S-DAD1植物表达载体,利用叶盘法转化烟草获得转基因烟草植株。在PEG6000模拟干旱、盐(NaC l)胁迫条件下,对转基因烟草的相对含水量、脯氨酸、丙二醛的含量进行测定分析。结果表明:转基因烟草对干旱、高盐的耐受性都有一定程度的提高。说明DAD1衰老调节因子基因可以减缓烟草在逆境条件下的衰老,提高了烟草的抗逆性。