杂色鲍DAD1的克隆及在发育、弧菌感染、高温和缺氧下的表达分析

抗细胞凋亡因子(DAD1)是细胞凋亡的负调控因子。在杂色鲍转录组测序的基础上,通过RACE的方法,获得了杂色鲍DAD1基因的全长c DNA,命名为HdDAD1。该序列全长553 bp,开放阅读框339 bp,编码112个氨基酸。编码蛋白具有保守的DAD功能域和3段跨膜区。实时定量PCR结果表明,HdDAD1在杂色鲍所检测组织中均有表达,消化道、鳃、血细胞、粘液腺和肾脏中表达量最高。同样,HdDAD1在发育各阶段均有表达,幼虫阶段表达量最高,原肠胚次之,其他胚胎发育阶段和稚鲍表达量最低。HdDAD1能够响应细菌感染、高温和缺氧应激。在弧菌注射12 h后,表达量显著上升。当水温由最适的25°C上升到28°C时,HdDAD1表达量升高;在31°C持续4和96 h时HdDAD1表达量显著上升。在低氧处理4和96 h时,HdDAD1的表达量也显著上升。

脊尾白虾抗细胞凋亡因子DAD1基因的克隆及其组织表达分析

取健康脊尾白虾（Exopalaemoncarinicauda）成体，体长（5．81±0．32）cm，体质量（1．18±0．35）g。根据本实验室已构建的脊尾白虾血细胞全长CDNA文库进行EST测序分析，获得脊尾白虾抗细胞凋亡因子DADl基因的cDNA全长并命名为EcDADl基因。该序列全长645bp，包括5非编码区184bp，开放阅读框345bp和3非编码区116bp，共编码114个氨基酸，预测分子量为12．85kD，理论等电点为8．75。同源性分析表明，脊尾白虾抗细胞凋亡因子EcDAD1氨基酸序列与其他物种DAD1有高度同源性，与斑节对虾（Penaeusmonodon）的相似性最高，为92％；与其他无脊椎动物的相似性为73％～80％。系统进化分析表明，脊尾白虾EcDAD1与斑节对虾的DAD1紧密聚为一支。荧光定量PCR分析结果表明，EcDAD1基因在脊尾白虾血细胞、鳃、肝胰腺、肌肉、卵巢、肠、胃和眼柄中均有表达，其中卵巢中的相对表达量最高。感染鳗弧菌（Vibrioanguillarum）和WSSV后6h和12h，脊尾白虾血细胞和肝胰腺中EcDAD1的表达量较对照组均显著增加（P〈0．01），且不同时间点间差异显著，表明EcDAD1基因可能在脊尾白虾抵抗病原体入侵机体的过程中具有重要作用。

超级稻DAD1基因的cDNA克隆及其正反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从超级稻幼苗中扩增DAD1基因的cDNA,并克隆测序,核酸序列表明该基因编码区为342bp,编码114个氨基酸残基.与GenBank发表的序列(XM_472334)相比,有3处碱基不同,分别为105bp处的C(GenBank的为T),148bp处的A(G),149bp处的C(T).将该基因分别正向和反向插入CaMV35S启动子后,构建了基因在植物中的正义、反义表达载体.

Sj Dad1反义核酸抗日本血吸虫感染的实验研究

目的 进一步鉴定已获得的日本血吸虫新基因 Ｓｊ Ｄａｄ１的功能。方法 构建Ｓｊ Ｄａｄ１反义（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）核酸载体ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１和正义（ｓｅｎｓｅ）核酸载体 ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄｅｄ１．ＢＡＬＢ／ｃ小鼠感染日本血吸虫尾蚴后第 ３天，通过小鼠尾静脉分别注射ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）、空载体和生理盐水。４５ｄ后解剖实验小鼠进行保护性效果评价。结果 在ＰＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄ１（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）组、ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－Ｓｊ Ｄａｄｌ（ｓｅｎｓｅ）组以及ｐＥＧＦＰ－Ｎ３组小鼠肺部冰冻切片检查发现在童虫周围有绿色荧光出现，而在生理盐水组则无此现象。但各实验组保护性效果无统计学差异（Ｐ＞ ０．０５）。结论Ｓｊ Ｄａｄ１反义核酸无明显的抗日本血吸虫感染的效果，尚需寻找其它方法对 Ｓｊ Ｄａｄ１的疫苗候选基因价值作进一步的鉴定。

陆地棉抗凋亡基因DAD1同源拷贝的非对称性驯化改变

抗凋亡基因DAD1是细胞程序性死亡的抑制基因,在植物生长发育中发挥重要作用。为探讨该基因在具有AADD基因组的异源四倍体陆地棉驯化过程中的遗传改变,本研究选取了陆地棉的野生和栽培样品作为研究对象,结合分子克隆、测序以及棉纤维不同发育阶段的转录组数据分析等方法,对二者在DAD1基因序列和表达水平的差异进行了深入比较,结果显示:陆地棉中,DAD1基因同时具有A和D基因组的2个同源拷贝;驯化对这2个拷贝的影响是不均衡的,其中A基因组的拷贝在基因序列上保持一致,但在表达上出现分化;D基因组拷贝在基因序列上出现了5个核苷酸的变异,包括1个发生在外显子区的同义突变,但在表达上却未出现明显变化。我们目前的研究结果展示了驯化对多倍体植物重要功能基因同源组分的影响是独立的,非对称性的。