人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体构建与在人髓母细胞瘤DAOY细胞中表达

目的构建人pEGFP-C2-PRDX3真核表达载体,并检测其在人髓母细胞瘤DAOY细胞中的表达。方法从人髓母细胞瘤DAOY细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法对编码PRDX3的基因片段进行扩增,应用基因重组技术,将目的片段亚克隆到pEGFP-C2真核表达载体,经PCR、酶切和测序鉴定后,用脂质体法将重组质粒转染入DAOY细胞,分别采用RT-PCR法、West-ern blot法检测PRDX3在DAOY细胞中的表达。结果双酶切及测序结果验证PRDX3片段正确插入pEGFP-C2质粒,转染后的PRDX3基因mRNA及蛋白质水平均明显上调。结论成功构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达载体pEGFP-C2-PRDX3,为进一步研究PRDX3基因在人髓母细胞瘤中的生物学功能奠定了基础。

人MEF2C基因shRNA慢病毒载体构建及其对Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响

目的构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)基因短发卡RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对髓母细胞瘤Daoy细胞MEF2C mRNA表达的影响。方法设计MEF2C基因特异性siRNA靶点,构建于慢病毒pGLV3/H1/GFP/Puro载体,筛选有效shRNA慢病毒载体,继而在293T细胞中包装成病毒颗粒,将其感染髓母细胞瘤Daoy细胞,Real-time PCR检测MEF2C mRNA。结果构建的MEF2C基因shRNA慢病毒载体测序正确,包装获得的shR-NA慢病毒颗粒感染Daoy细胞后其MEF2C mRNA表达量较阴性对照组下降了81.1%。结论成功构建了MEF2C基因shRNA慢病毒表达载体并包装成慢病毒颗粒,其能够有效抑制MEF2C mRNA的表达。

人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制髓母细胞瘤Daoy细胞增殖并促其凋亡

背景:间充质干细胞能够产生大量的与其生物学功能相似的外泌体,但间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞的影响仍不清楚。目的:探讨人脐带间充质干细胞来源外泌体对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡的影响以及可能机制。方法:分离、培养人脐带间充质干细胞,提取第4代人脐带间充质干细胞来源外泌体,Western blot检测外泌体标志蛋白CD9和CD81的表达。将人脐带间充质干细胞来源外泌体与Daoy细胞共培养96 h,采用流式细胞术、克隆形成实验检测Daoy细胞的增殖情况;流式细胞术检测Daoy细胞的凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果与结论:Western blot检测人脐带间充质干细胞来源外泌体CD9和CD81呈阳性表达。与对照组比较,人脐带间充质干细胞来源外泌体抑制Daoy细胞增殖和克隆形成(P<0.05,P<0.01);促进Daoy细胞凋亡(P<0.01);凋亡相关蛋白Cyclin D1和Bcl-2表达下调(P<0.05),Caspase-3表达上调(P<0.01)。结果表明,人脐带间充质干细胞来源外泌体可能通过调节细胞周期以及凋亡相关蛋白表达来抑制髓母细胞瘤Daoy细胞的增殖,并促进其凋亡。

GANT61对髓母细胞瘤Daoy细胞增殖、凋亡的影响及作用机制

目的探讨GANT61对髓母细胞瘤(MB)Daoy细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。方法将人MB Daoy细胞正常培养24 h,然后分为4组:A组,培养液中加入0.1%二甲基亚砜(DMSO);B组,培养液中加入10μmol/L GANT61和0.1%DMSO;C组,培养液中加入20μmol/L GANT61和0.1%DMSO;D组,培养液中加入40μmol/L GANT61和0.1%DMSO。采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测GLI家族锌指蛋白1(GLI1)mRNA、GLI家族锌指蛋白2(GLI2)mRNA的相对表达量,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21反胱天蛋白酶3(caspase 3)的表达水平,采用流式细胞术检测细胞周期。结果培养24 h后,C组和D组细胞的光密度(OD)值均低于A组,差异均有统计学意义(P<0.05);培养48 h后,C组和D组细胞的OD值均低于A组,D组细胞的OD值低于B组和C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。C组和D组细胞中GLI1 mRNA和GLI2 mRNA的相对表达量均低于A组,D组细胞中GLI1 mRNA和GLI2 mRNA的相对表达量均低于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。C组和D组细胞中cyclin D1蛋白表达水平均低于A组和B组,p21、caspase 3蛋白表达水平均高于A组和B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。B组、C组和D组中G0/G1,期细胞比例均高于A组,G2/M期细胞比例均低于A组,差异均有统计学意义(P<0.05);C组和D组中G0/G1,期细胞比例均高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论GANT61对MB Daoy细胞具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,可能是通过调节GLI1、GLI2的mRNA水平进而影响cyclin D1、p21及caspase 3蛋白表达来实现。

YBX1截短体抑制髓母细胞瘤DAOY的迁移和干性增殖能力

[目的]利用CRISPR/Cas9技术构建YBX1基因截短的SHH型髓母细胞瘤DAOY细胞系,探讨截短的YBX1对DAOY细胞迁移和干性增殖的影响。[方法]设计针对YBX1基因的sgRNA序列,并将其插入pX330载体构建sgYBX1表达质粒。DAOY细胞经pX330-sgYBX1和耐青霉素质粒转染,药筛后采用极限稀释法挑取单克隆细胞系,使用测序及蛋白质印迹技术检测YBX1基因编辑的情况,利用免疫荧光实验检测YBX1截短体在DAOY细胞内的定位情况,并通过CCK8、Transwell、克隆形成实验、低黏附板成球实验检测YBX1截短体对DAOY细胞增殖、迁移及干性的影响。[结果]测序结果表明,在DAOYYBX1-trunc细胞系中,YBX1基因编码区缺失144个碱基,导致合成肽段的第21~68氨基酸(位于A/P domain和CSD结构域)缺失。免疫荧光实验结果表明截短的YBX1蛋白定位富集在细胞核内。与未编辑细胞相比,DAOYYBX1-trunc细胞的增殖能力基本不变,但迁移能力减弱了50%,克隆形成能力削减了54%,细胞成球能力削减了68%。[结论]成功构建YBX1蛋白在21~68氨基酸截短的DAOY细胞系,其削弱了DAOY细胞的迁移及干性增殖能力。

白藜芦醇对人髓母细胞瘤细胞Daoy增殖的影响及其作用机制

目的探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对人髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)Daoy细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法体外培养Daoy细胞,用不同浓度的Res(10、20、40、80μmol/L)作用不同时间(24、48和72 h),CCK-8法检测Res对Daoy细胞的增殖抑制率;电镜观察Res对细胞内自噬溶酶体的形成情况;Cathepsin D活性检测试剂盒检测Cathepsin D活性;Western blot法检测Daoy细胞中Beclin 1、LC3、p62和溶酶体相关膜蛋白2(lysosomeassociated membrane proteins 2,LAMP2)的表达及3-甲基腺嘌呤(3-MA)和巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)对Res作用的影响。结果 Res作用后,Daoy细胞的增殖抑制率随Res浓度的升高及作用时间的延长呈升高趋势;随着Res浓度的升高,Daoy细胞内自噬溶酶体形成数量、Cathepsin D酶活性、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1、LAMP2蛋白的表达均呈上升趋势,p62蛋白表达下降。3-MA作用后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、Beclin 1、LAMP2的蛋白表达水平明显下降(P <0. 05),p62的表达水平明显上调(P <0. 05);Bafilomycin A1处理后,Beclin 1、p62及LAMP2表达明显降低(P <0. 05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值明显增高(P <0. 05)。结论 Res可抑制髓母细胞瘤细胞Daoy的增殖,其机制可能与Res促进自噬形成与成熟过程有关。

沉默MEF2C基因对髓母细胞瘤Daoy细胞形态结构的影响

目的探讨抑制人MEF2C基因后对髓母细胞瘤Daoy细胞形态结构的影响作用。方法实验分为两组:对照组和干扰组。对照组Daoy细胞培养感染阴性慢病毒液,干扰组Daoy细胞培养感染MEF2C-RNAi慢病毒液。光镜下观察培养细胞的大体形态,然后利用透射电镜观察细胞的超微结构变化情况。同时将两组细胞分别接种至裸鼠背部皮下,观察裸鼠成瘤情况以及肿瘤组织的光镜下结构和电镜下超微结构变化情况。结果干扰组Daoy细胞生长较对照组细胞生长缓慢,种植裸鼠后成瘤重量较对照组轻;光镜下显示对照组瘤组织细胞较干扰组瘤组织细胞排列密集;电镜下显示干扰组瘤组织细胞排列疏松,核固缩,凋亡小体形成。结论沉默MEF2C基因可以引起异染色质减少、凋亡小体形成,影响细胞的形态结构,抑制肿瘤细胞生长,为其肿瘤生物治疗提供了实验依据。

siRNA沉默CD99基因对人髓母细胞瘤Daoy细胞株迁移和侵袭能力的影响

目的研究细胞黏附分子CD99对人髓母细胞瘤Daoy细胞株迁移及侵袭能力的影响及可能机制。方法采用化学合成CD99基因的小干扰RNA(CD99 siRNA)下调该基因表达,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)检测转染后的细胞内CD99、基质金属蛋白酶2(matirx metallo-proteinases 2,MMP 2)和MMP 9的表达,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测CD99对Daoy细胞迁移和侵袭的影响。结果 CD99-siRNA-2#能有效降低Daoy细胞株中CD99 mRNA和蛋白水平的表达,沉默后细胞的迁移和侵袭能力均显著降低,进一步检测发现MMP 9的mRNA水平亦明显下调,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 CD99基因对髓母细胞瘤Daoy细胞的迁移和侵袭能力相关,CD99可能通过影响MMP 9的表达参与其中,有望成为髓母细胞瘤治疗的靶点。

客户/服务器/客户模型与DAOIS

文中提出了一种新的网络计算模型－客户／服务器／客户模型（ＣＳＣ），并提出ＣＳＣ的一种支撑环境－分布式应用对象交互服务模型ＤＡＯＩＳ．该模型主要面向松散型的分布式独立应用系统的开发与集成，以平台级的、应用独立的、悬挂式的、网络透明平台透明应用代码透明的“软插件”为基础，辅以“包装”式的构造协议．

基于CSC的分布式应用对象交互服务模型DAOIS的研究

介绍一种新的分布式计算支撑模型与工具──分布式应用对象交互服务模型ＤＡＯＩＳ。它主要面向松散型的分布或独立应用系统的开发与集成。以ＣＳＣ为工作与构造模型，以平台级的、应用独立的、悬挂式的、网络透明平台透明应用代码透明的“软插件”为基础，辅以“包装”式的构造协议。

黔北地区奥陶纪—志留纪之交黑色页岩地球化学特征及意义——以贵州道真道页1井为例

奥陶纪—志留纪之交是华南被动大陆边缘盆地向前陆盆地演化的重要转折时期,形成广泛分布的五峰组—龙马溪组黑色页岩。为进一步探讨该套黑色页岩的形成背景,以黔北地区道页1井为例,开展沉积序列和地球化学研究。研究结果表明:五峰组及龙马溪组底部主要为硅质碳质页岩,夹多层斑脱岩,U/Th为0.2~2.90,V/Cr为1.18~14.34,Ni/Co为2.31~11.59,TOC为0.68%~5.91%,平均3.76%,稀土配分曲线为平坦型,δEu以弱正异常为主、个别为弱负异常;龙马溪上部及新滩组主要由泥岩及钙质泥岩组成,U/Th为0.16~0.23,V/Cr为0.88~1.79,Ni/Co为1.77~3.91,TOC为0.1%~0.84%,δEu以明显负异常为主,表现出低斜率右倾型稀土配分曲线。以上特征表明五峰组及龙马溪组底部形成于间歇性缺氧的还原环境,龙马溪组上部及新滩组为富氧环境。结合斑脱岩的分布特征综合分析认为,五峰组及龙马溪组底部页岩是汇聚背景下前陆盆地早期沉积的产物,强烈火山作用给大陆边缘海带来营养元素,刺激初级生产力的增加,造成水体迅速缺氧,可能是造成同期海底缺氧的主要诱因。

三种特早熟温州蜜柑品质比较研究

[目的]比较3种特早熟温州蜜柑‘稻叶’、‘大浦’、‘大分’外观和内在品质差异,为其上市时间提供参考。[方法]通过纵横径、单果重、可食率、瓣数和果皮叶绿素等外观形态,以及果肉可溶性固形物、可溶性糖、可滴定酸、Vc、类胡萝卜素、总酚、类黄酮等内在品质指标,分析3种特早熟温州蜜柑的内外在品质。[结果]3个品种果皮薄而光滑,呈青绿色,果实形状多为扁圆形,瓣数为9~13瓣,其中,大浦、大分果形较大,稻叶果形偏小。内在品质方面,稻叶和大分的可溶性固形物含量差异较小且高于大浦;稻叶的可溶性糖和类胡萝卜素含量最高,大分次之,大浦含量最低;另外,稻叶的可滴定酸、Vc、总酚含量最高,大分最低,大浦介于两者之间;在糖酸比方面,大分最高,稻叶次之,大浦最低。[结论]大分的内外品质较好,具有较好的市场前景。

Nkx2．2对髓母细胞瘤细胞恶性表型的调控作用

目的：探究转录因子NKX2．2（NK2 homeobox 2）在小鼠髓母细胞瘤（medulloblastoma， MB）中的表达及其对人源MB细胞系Daoy增殖、迁移能力的影响。方法采用实时定量PCR检测Nkx2．2在MB和野生型小鼠小脑组织中mRNA水平的表达差异，并通过免疫组化进一步检测其差异；设计针对Nkx2．2的小干扰RNA，分别通过实时定量 PCR 和 Western 印迹检测 Nkx2．2的干涉效率；干涉 Daoy 细胞中的Nkx2．2后采用CCK？8、平板克隆形成实验检测Nkx2．2基因沉默对Daoy细胞增殖和迁移能力的影响，流式细胞术检测细胞凋亡，划痕实验评价细胞迁移能力。结果 NKX2．2在小鼠MB中的表达明显低于正常组织；沉默Nkx2．2能显著促进MB细胞的增殖且抑制其凋亡，但不影响细胞迁移。结论 Nkx2．2能抑制MB细胞的增殖并促进其凋亡，其下调可能参与MB的发生。