DBC2基因诱导乳腺癌细胞周期G_1期阻滞的机制

目的研究肿瘤抑癌基因DBC2(deletion in breast cancer2)抑制乳腺癌MDA-MB-435S细胞增殖的可能机制。方法野生型DBC2基因的真核表达载体pEBG-DBC2瞬时转染MDA-MB-435S细胞72h,RT-PCR方法证实DBC2基因的过表达;流式细胞术检测DBC2的瞬时过表达对MDA-MB-435S细胞周期的影响,Western blot检测DBC2的过表达对细胞周期蛋白CyclinD1表达的作用。结果DBC2基因在MDA-MB-435S细胞中瞬时转染72h后,其mR-NA表达水平即可成倍增加,同时DBC2基因的过表达可诱导该乳腺癌细胞周期的G1期阻滞,并随着时间的延长出现细胞凋亡。结论DBC2基因体外抑制乳腺癌细胞生长的功能,可能通过抑制CyclinD1的表达并使细胞停滞于G1期,以及诱导细胞凋亡等机制实现。

中国人群DBC2基因突变与乳腺癌的关系

目的:检测乳腺癌患者DBC2基因启动子和第7外显子及其两翼部分内含子区域的突变情况,探讨DBC2基因突变与乳腺癌发病风险的关系。方法:收集长海医院32例乳腺癌患者的组织标本,提取DNA后,对DBC2基因启动子、第7外显子及其侧翼部分内含子进行PCR扩增,通过直接测序法鉴定DNA突变位点。另取18例乳腺良性肿瘤组织标本作为对照。结果:研究组和对照组都没有发现启动子或第7外显子突变。在13例组织标本中发现DBC2第7内含子IVS7+53C>G突变,研究组和对照组的突变率分别为25.00%(8/32)和27.78%(5/18),2者差异无统计学意义(P>0.05)。IVS7+53C>G突变患者与野生型患者在年龄分布上差异无统计学意义(P>0.05)。DBC2基因IVS7+53C>G突变与肿瘤大小、淋巴结状态以及雌激素受体和孕激素受体表达与否等临床特征无统计学相关性(P>0.05)。但是IVS7+53C>G突变患者HER2和p53表达率显著高于野生型患者,提示IVS7+53C>G突变与HER2和p53表达相关(P<0.05)。结论:DBC2基因启动子及第7外显子突变可能在中国人群中并不常见,与乳腺癌发病风险无关。IVS7+53C>G突变是中国人群中一种常见的多态性,与乳腺癌发病风险的关系尚待今后更大样本量的研究予以论证。

DBC2在胃癌中的甲基化

目的检测DBC2在胃癌组织中的表达水平及其基因启动子区的甲基化状态,从而探讨二者的相关性。方法选取92例胃癌组织及其相应的癌旁组织为研究对象,通过RT-PCR方法检测DBC2 m RNA表达水平,并利用MS-PCR方法检测DBC2启动子区的甲基化状态,同时分析胃癌组织中DBC2启动子区甲基化水平与临床病理因素的相关性。结果与癌旁组织相比,胃癌组织中DBC2的表达水平降低,同时伴随其启动子区高甲基化。其甲基化水平与肿瘤浸润深度、分化程度及TNM分期密切相关(P<0.05),随着肿瘤浸润深度的增加、分化程度的降低以及TNM分期的提高,胃癌组织中DBC2启动子区具有更明显的甲基化水平。结论胃癌中DBC2启动子区高甲基化可能是导致其表达水平降低的一个重要原因。

三阴性乳腺癌中DBC2的表达及其临床病理意义

目的探讨乳腺癌缺失基因2(deleted in breast cancer2,DBC2)在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中的表达,分析其临床病理学意义。方法收集195例乳腺癌标本,采用免疫组化SP法检测38例TNBC、50例非三阴性乳腺癌(non-triple negative breast cancer,NTNBC)和30例正常乳腺组织中DBC2的表达;应用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization,FISH)检测38例TNBC中HER-2基因扩增。结果正常乳腺组织中仅2例DBC2表达缺失(2/30),NTNBC组中21例DBC2表达缺失(21/50);TNBC组中19例DBC2表达缺失(19/38),其表达缺失率高于NTNBC组和正常乳腺组。结论 TNBC中DBC2表达明显缺失,其与肿瘤的增殖和高侵袭性相关,有望成为TNBC靶向治疗的潜在靶点。

抑制DBC2基因启动子甲基化促进乳腺癌细胞凋亡的研究

目的研究抑癌基因DBC2在乳腺癌的表达与甲基化状态之间的联系,及其对乳腺癌细胞系T-47D细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养3种乳腺癌细胞株(T-47D、MCF-7、MDA-MB-23)和正常乳腺细胞株(MCF-10),检测4种细胞中DBC2基因的表达及其启动子区甲基化状况;5-Aza-Cd R处理T-47D细胞后,检测5-Aza-Cd R对T-47D细胞DBC2启动子甲基化状态和其表达的影响,并通过MTT和Annexin-V/PI双染法分别检测处理前后T-47D细胞增殖和凋亡的变化。结果 DBC2在T-47D细胞表达缺失,乳腺癌细胞DBC2启动子发生甲基化;5-Aza-Cd R成功逆转了T-47D细胞DBC2的甲基化状态,并使DBC2 m RNA表达恢复(P<0.05);不同浓度的5-Aza-Cd R处理T-47D细胞后,T-47D细胞增殖下降(P<0.05),凋亡率增加(P<0.05)。结论 DBC2启动子甲基化导致T-47D细胞DBC2表达沉默,激活DBC2表达可抑制T-47D细胞增殖并促进其凋亡。

Construction of recombinant type 5 adenovirus expressing human DBC2 gene in bladder cancer cells

Objective:The aim of the study was to construct recombinant type 5 adenovirus expressing the human DBC2(deleted in breast cancer 2) gene for in vitro and in vivo assay in human bladder cancer research.Methods:The human DBC2 gene was first subcloned into a shuttle plasmid pAdTrack-CMV.After recombining with pAdEasy-1 vector in BJ5183 cells,the new recombinant vector pAdEasy-DBC2-CMV was transfected into HEK-293 cells to produce adenovirus.The human bladder cancer cell line T24 was infected with DBC2-containing adenovirus particles.Both RNA and protein were collected from cells harvested at 72 h after infection.Real time quantitative PCR(qPCR) and Western blot were used to examine mRNA and protein levels.Fluorescence microscopy was utilized to observe the expression of reporter green fluorescence protein.Results:Electrophoresis showed there was a 2.2 kb size band produced from high fidelity PCR.Pac I digest of the final produced recombinant vector yielded band sizes of approximately 30 kb and 4.5 kb.After virus infection with the pAdEasy-DBC2-CMV vector,the T24 cell line was observed to highly express green fluorescence protein under a fluorescence microscope.qPCR and Western blot assay identified that the DBC2 gene was overexpressed at both the mRNA and protein levels in virus transfected cells.Conclusion:By using the pAdEasy adenovirus system,we successfully constructed an adenovirus that could highly overexpress the tumor suppressor DBC2 gene in a bladder cancer cell line.This viral construct would be widely used for our further research in gene functional assays and gene therapy in bladder cancer.

BRCA1、BRCA2和DBC2基因突变与华东地区早发性乳腺癌发病关系

目的检测华东地区早发性乳腺癌患者BRCA1、BRCA2和DBC2基因突变情况,探讨其基因多态性与早发性乳腺癌发病风险的关系。方法研究对象为40例家族史阴性的早发性乳腺癌患者(发病年龄≤40岁),中位发病年龄37岁(24～40岁);30名年龄匹配的健康志愿者作为对照。提取外周血DNA,对BRCA1基因第11和第24外显子、BRCA2基因第11外显子以及DBC2基因第5外显子的编码序列进行PCR扩增,通过直接测序法鉴定DNA突变位点。结果研究组和对照组均没有发现BRCA1基因第24外显子、BRCA2基因第11外显子突变。在BRCA1基因第11外显子发现exon11+3232A>G突变18例,其中乳腺癌患者13例(包括5例纯合性突变),健康志愿者5例。研究组和对照组突变频率分别为32.50%(13/40)和16.67%(5/30),两者差异没有统计学意义(P>0.05)。研究组和对照组G等位基因携带率分别为22.50%和8.30%,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。在DBC2基因第5外显子发现exon5+382C>T突变8例,均为乳腺癌患者,突变频率为20.00%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论BRCA1第24外显子、BRCA2第11外显子突变可能在华东地区人群中不常见,与该地区早发性乳腺癌发病风险无关。BRCA1基因exon11+3232A>G突变、DBC2基因exon5+382C>T突变,可能增加该地区早发性乳腺癌发病风险,值得今后进一步研究验证。

DBC2基因突变与上海地区早发性乳腺癌相关性的研究

目的:检测上海地区早发性乳腺癌患者DBC2基因启动子及第7外显子突变情况,探讨DBC2基因突变与早发性乳腺癌发病风险的关系。方法:提取45例家族史阴性的早发性乳腺癌患者和36名健康志愿者外周血基因组DNA,对DBC2基因启动子、第7外显子及其侧翼部分内含子序列进行PCR扩增,通过直接测序法鉴定DNA突变位点。结果:研究组和对照组均未发现启动子或第7外显子突变;在第7内含子发现IVS7+53C>G突变23例,研究组和对照组DNA的突变率分别为26.67%(12/45)和30.56%(11/36),两者差异无统计学意义,P>0.05。IVS7+53C>G突变患者平均发病年龄为38.33岁,比IVS7+53野生型患者大3.64岁,两者差异有统计学意义,P<0.05。结论:DBC2基因启动子及第7外显子突变可能在上海地区人群中不常见,与早发性乳腺癌发病风险无关。IVS7+53C>G突变是中国人群一种常见多态性,与早发性乳腺癌发病风险关系尚待进一步研究。

突变敏感性分子开关对乳腺癌DBC2基因7776C〉T突变的快速检测

目的应用硫化磷酸修饰的碱基特异性引物和高保真DNA聚合酶所构成的突变敏感性分子开关技术结合琼脂糖凝胶电泳，快速检测乳腺癌及乳腺纤维腺瘤中DBC2基因7776C〉T突变频率。方法设计2对分别与DBC2基因7776位点突变碱基（C）和野生碱基（T）配对的硫化磷酸修饰的引物，硫化磷酸修饰等位基因位点特异性引物与组织DNA样本完全配对时，能被高保真聚合酶延伸，而硫化磷酸修饰等位基因位点特异性引物与组织DNA样本不完全配对时，不能被高保真聚合酶延伸。用此突变敏感性分子开关技术对85例乳腺癌组织DNA样本及10例乳腺纤维腺瘤组织DNA样本进行PCR检测，并利用凝胶成像系统对PCR产物进行分析。结果利用分子开关技术在85例乳腺癌组织DNA样本中检测出DBC2基因7776C〉T突变率为2．4％（2／85），10例乳腺纤维腺瘤未发现该突变。结论该突变敏感性分子开关技术结合琼脂糖凝胶电泳可快速检测乳腺癌DBC2基因7776C〉T突变。突变敏感性分子开关技术可在单碱基水平对相关基因突变进行特异性检测，提示其在乳腺癌等基因突变检测中具有广阔的应用前景。

抑癌基因研究新进展

乳腺癌缺失基因2(deleted in breast cancer 2,DBC2)、亮氨酸拉链基序编码基因1 (leucine zipper tumor suppressor 1,LZTS1)和低密度脂蛋白受体相关蛋白1B基因(low density lipoprotein receptor-related protein 1B,LRP1B)是近年来研究较热的3种可能的抑癌基因,越来越多的证据显示这几个基因的突变、异常表达或者增强子的甲基化异常等与多种肿瘤的发生有密切关系。对其进一步的研究将对多种肿瘤的预防和治疗大有裨益。

抑癌基因RhoBTB2及其与乳腺癌的研究进展

RhoBTB2基因（rho—related BTB domain—containing 2，RhoBTB2）是2002年美国学者发现的乳腺癌主要候选抑癌基因。RhoBTB2蛋白质能够编码信号转导蛋白，参与各种信号转导途径，并通过影响细胞凋亡及细胞周期来调节细胞的生长。在正常乳腺组织中，RhoBTB2均呈低量但稳定的表达，而在3．5％的原发性乳腺癌中发生纯合性缺失，在58％的乳腺癌中表达缺失。它是目前与90％的散发性、非家族性乳腺癌相关的少数基因之一。