差异竞争性PCR定量扩增胃癌及转移灶癌基因HER2和C-myc

目的 介绍差异竞争性多聚酶链反应（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＤＣ－ＰＣＲ），并分析癌基因 ＨＥＲ２和Ｃ－ｍｙｃ变异与胃癌生物学行为的关系。方法用ＤＣ－ＰＣＲ定量检测胃原发癌、癌旁、转移淋巴结及远处脏器转移癌中ＨＥＲ２和Ｃ－ｍｙｃ扩增。结果 ＨＥＲ２扩增频率在近端胃癌组中高于远端胃癌组（分别是８４．６％和２６．３％，Ｐ＜０．０５），侵及浆膜组明显高于未侵及浆膜组（６６．７％和２８．６％，Ｐ＜０．００５）。Ⅳ期胃癌与Ｉ、Ⅱ期胃癌组间ＨＥＲ２扩增值有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。Ｃ－ｍｙｃ在胃癌原发灶及转移淋巴结中的扩增频率分别是１８．８％和２３．８％，２例远处脏器转移癌中有扩增。结论ＨＥＲ２和Ｃ－ｍｙｃ扩增与胃癌进展有关。近、远端胃癌可能有不同的遗传学途径。ＤＣ－ＰＣＲ是一项敏感可靠的基因定量技术。

葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

【目的】优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持。【方法】采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg^(2+)浓度、Taq DNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证。【结果】最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00 ng,dNTPs 0.25 mmol/L,Mg^(2+)1.50 mmol/L,引物0.80μmol/L,Taq DNA聚合酶0.50 U。利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物。使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性。【结论】建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究。

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。

内蒙古小花棘豆遗传多样性的ISSR分析

应用ISSR分子标记对内蒙古西部地区小花棘豆(Oxytropis glabra DC.)6个地理种群进行了遗传多样性研究.结果表明:小花棘豆具有较高的遗传多样性;14个引物共扩增出327个位点,物种水平上Nei's基因多样性指数为0.1972,Shannon多样性指数为0.3287;种内总基因多样性为0.1976,种群内基因多样性为0.1653,83.67%的遗传变异存在于种群内,16.33%的遗传变异存在于种群间,种群间的遗传分化系数为0.1633,基因流为2.5613,6个种群间有一定遗传分化,但遗传漂变不会引起遗传分化.UPGMA遗传距离聚类结果表明,生态地理条件相似的种群优先聚集.

基于特异性PCR和荧光检测技术快速鉴定艾纳香

为建立快速准确的艾纳香分子鉴定方法。采取筛选艾纳香及其混伪品基因组DNA的提取方法,针对艾纳香特异性位点设计引物,优化PCR扩增条件,荧光检测扩增产物。结果表明碱裂解法更适于艾纳香基因组DNA的提取;叶绿体基因(t DNA)特异引物能特异性扩增艾纳香DNA,其扩增产物荧光检测呈绿色,混伪品无反应发生。试验结果显示该法简化了分子鉴定过程,省时节力,且结果准确可靠,可作为艾纳香植物和药材的鉴定方法。

柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系；筛选适宜引物，并确定最佳退火温度。方法CTAB法提取叶片DNA，通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件，利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25μl总体积中含有1×Taq酶缓冲液，2．0mmol／L MgCl2，各0．15mmol／L的dNTPs，0．3μmol／L引物，1．5U Taq酶（上海生工），20ng模板DNA，2％去离子甲酰胺。在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物，最佳退火温度为49．9～63．6℃（因引物不同而异）。结论建立了柴胡ISSR—PCR反应体系，筛选出30条引物并确定了最佳退火温度，为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。

胡萝卜肉质根线粒体DNA提取方法研究

本研究以胡萝卜根为材料,通过高盐差速离心和蔗糖沉淀差速离心两种方法提取线粒体DNA。通过改变缓冲液、使用DNaseⅠ处理得到了无核DNA污染的线粒体。用SDS和蛋白酶K裂解线粒体,经酚:氯仿:异戊醇抽提除去蛋白,并用RNaseA消化从而得到单纯线粒体DNA。本实验还特别设计了叶绿体特异性引物检测线粒体DNA纯度。结果表明:利用优化后的蔗糖沉淀差速离心法提取胡萝卜线粒体DNA,所得线粒体DNA纯度高、产量高,每克肉质根能够得到27.60μg线粒体DNA。

柴胡属药用植物多重实时荧光PCR检测方法的建立

目的用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)方法测定正品柴胡,为柴胡的分子鉴定提供依据。方法从柴胡根茎中提取总DNA,根据ITS2序列,设计合成针对南柴胡和北柴胡的特异性引物和探针以及柴胡的通用引物与探针,通过对荧光聚合酶链式反应反应体系和反应条件的优化筛选,建立了多重实时荧光聚合酶链式反应方法,在同一聚合酶链式反应反应体系中可以同时鉴别南、北柴胡。结果结果表明本试验设计的引物和探针具有很好的物种特异性,且灵敏度高,DNA检出限为0.08 ng。对46份样品检测,其中17份检出北柴胡源性成分,5份为南柴胡,其他样品均检测为伪品柴胡,检测结果与DNA测序结果一致。结论该方法可以有效地鉴别出南、北柴胡源性成分,及伪品柴胡,对于保证柴胡药材的质量及用药安全具有重要意义。

茅苍术麸炒前后胃黏膜保护作用的变化研究

目的:比较茅苍术生品和麸炒品对胃溃疡大鼠的胃黏膜保护作用。方法:以乙酸诱导大鼠胃溃疡模型。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清及胃组织中表皮生长因子(EGF)和三叶因子2(TFF2)的含量。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测胃组织中EGF和TFF2 mRNA的表达。免疫组织化学法检测胃组织中EGF和TFF2的蛋白表达。结果:茅苍术能够明显升高血清及胃组织中EGF和TFF2的含量,上调胃组织中EGF和TFF2mRNA的表达和二者的蛋白表达量,麸炒品的作用优于生品。结论:麸炒能增强茅苍术对乙酸致胃溃疡大鼠胃黏膜的保护作用。

调控甘松中倍半萜类化合物积累的转录因子分析

目的筛选参与调控甘松Nardostachys jatamansi主要活性倍半萜类化合物积累的bHLH、bZIP、MYB家族转录因子。方法利用甘松全长转录组数据库注释信息获取bHLH、bZIP、MYB家族转录因子,利用WGCNA分析潜在能正向调控主要倍半萜类化合物积累的转录因子,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymeras chain reaction,qRT-PCR)进一步确认候选转录因子是否影响甘松主要活性倍半萜类化合物的积累,利用MEME在线网站分析候选bHLH、bZIP、MYB基因家族成员的保守基序。结果在甘松全长转录组数据中分别筛选出bHLH家族893个、bZIP家族416个、MYB家族436个,WGCNA分析筛选能正向调控萜类化合物生物合成的转录因子共458个,qRT-PCR确认候选转录因子的表达水平与甘松主要活性倍半萜化合物的积累水平高度正相关。结论甘松主要倍半萜类化合物的积累可能受到本研究筛选的458个转录因子的正向调控作用,可作为甘松主要药效物质生物合成调控机制研究的潜在靶基因。

北柴胡鲨烯合酶基因及其编码区cDNA克隆与序列分析

鲨烯合酶(EC.2.5.1.21,squalene synthase,SS)是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。为研究鲨烯合酶在柴胡皂苷生物合成中的作用,以北柴胡(Bupleurum chinense DC.)不定根为试材,采用Trizol法提取总RNA,利用RT-PCR方法从北柴胡中扩增出了鲨烯合酶cDNA特异片段,并进行了克隆、测序。测序结果显示得到了两个序列不同的cDNA(BcSS1和BcSS2),分别为1245bp和1248bp,分别编码414及415个氨基酸。BcSS1和BcSS2间的核苷酸和氨基酸一致性分别为98%和96%。NCBI Blastx结果显示与三岛柴胡和三七SS氨基酸序列相似性最高,BcSS1的一致性分别为99%和90%,BcSS2的分别为97%和87%。在此基础上,利用PCR技术从北柴胡不定根中扩增得到了一个SS基因克隆,长5880bp,包含12个内含子。

北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建

目的克隆北柴胡Bupleurum chinense中可能参与柴胡皂苷生物合成的糖基转移酶基因BcUGT8,构建其原核表达载体,为通过体外表达和纯化蛋白的催化活性,分析验证其功能奠定基础。方法在Roche(454)GS FLX系统高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)和长距离PCR扩增方法(LD-PCR)克隆全长cDNA。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增其开放阅读框(ORF),酶切后,插入到pET-28a(+)载体中,构建出原核表达载体。结果扩增到北柴胡1个糖基转移酶(UGT)基因全长cDNA,构建了这一基因的原核表达载体。结论通过BcUGT8基因的全长cDNA克隆、序列分析和原核表达载体的构建,为后续开展体外酶蛋白表达、纯化和催化活性分析实验,验证其生物功能奠定了基础。

基于实时荧光定量PCR分析的北柴胡内参基因的筛选及验证

目的筛选出在北柴胡不同生长时期及不同器官中表达均稳定的内参基因并进行验证。方法利用实时荧光定量PCR获得18个候选内参基因所有Ct值,通过3种不同算法(Bestkeeper、Norm Finder、Ge Norm)的软件对内参基因稳定性进行分析,采用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient)分析3个软件给出的稳定性排名结果。结果所有候选内参基因的Ct值相对宽泛,ADF1b、ADF5、ADF7、e IF2b和ACT2为最为合适的内参基因,而e IF6被认为稳定性最差的内参基因。3个软件计算结果均呈现显著性相关。结论采用实时荧光定量PCR结合3种不同算法进行北柴胡内参基因的筛选及验证是可行的。在北柴胡柴胡分子遗传研究中,发掘到的内参基因对目的基因进行均一化处理有助于提高目的基因表达分析的精确性及可信度。

树突状细胞C型凝集素在自然流产中的表达研究

目的通过检测早期自然流产患者子宫蜕膜组织中树突状细胞C型凝集素(DC-SIGN)的表达,探讨其在自然流产发生中的可能机制。方法采用免疫荧光染色法及实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测DC-SIGN在蜕膜组织中的表达,比较两组间表达情况及分布差异。结果 1.通过免疫荧光染色技术检测显示:妊娠期子宫蜕膜组织均表达DC-SIGN,主要分布于细胞膜上,自然流产组中DC-SIGN+DC表达明显低于对照组(46.20±2.40 vs 78.21±0.28,P<0.01)。2.RT-PCR结果显示:自然流产组明显低于对照组,患者蜕膜组织中DC-SIGN mRNA相对表达量(0.0032370±0.00124 vs0.0076412±0.0040,P<0.05)。结论树突状细胞(DC)在母胎免疫耐受机制中起着重要的作用,蜕膜组织DC-SIGN的表达量降低可能导致早期自然流产的发生。

北柴胡皂苷生物合成途径关键酶IPPI的全长cDNA克隆及其序列分析

目的克隆北柴胡皂苷生物合成途径关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶(EC 5.3.3.2,isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)的全长cDNA,为研究柴胡皂苷的生物合成与基因调控奠定基础。方法 PCR矩阵法快速筛选北柴胡全长cDNA文库。结果获得了北柴胡IPPI的全长cDNA(GenBank No.gq433719),其核苷酸序列长1 117bp,编码319个氨基酸的蛋白。NCBI Blastx结果显示与胡萝卜Daucus carotasubsp.sativus(abb52064)的IPPI氨基酸序列相似性最高,一致性为92%,相似度为97%。保守结构域搜索显示含有IPPI共有的催化活性位点、金属结合位点及Nudix基序。TargetP1.1和SignalP3.0分析表明北柴胡IPPI N端含有长26 bp的叶绿体信号肽。结论首次克隆了北柴胡IPPI的全长cDNA,将促进后续北柴胡IPPI基因表达特性及其在柴胡皂苷合成代谢中功能的研究。