DCD-1L在毕赤酵母中的克隆和表达

由于细菌对抗生素耐药性的产生 ,迫切需要寻求一种新的抗菌剂来代替它。DCD是最近从人汗腺中发现的具有广谱抗菌活性的抗菌肽。与抗生素不同 ,它不会在生物体内富集 ,也不会诱导产生耐药菌株。为了能快速并低成本地获得该肽 ,DCD 1L基因 ,第一次被克隆到毕赤酵母载体pPIC9中 ,并在毕赤酵母GS1 1 5中进行表达。实验结果显示毕赤酵母GS1 1 5系统所表达的DCD 1L在pH5 5～ 7 4范围内具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。这个结果说明在毕赤酵母中表达的DCD 1L能够抗部分革兰氏阴性和阳性细菌。

抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母中的表达及其条件优化

本文将抗菌肽DCD-1L在毕赤酵母SMD1168中表达并优化其表达条件。利用重叠延伸PCR法获得DCD-1L基因并将其重组到质粒pPICZα-A中；将重组质粒pPICZ-A—DCD-1L转化毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168并诱导表达；通过抑菌圈试验确定其最适表达时间、温度、pH值和甲醇诱导量。结果表明：最适表达时间为48h，温度为28℃，pH值为6，甲醇诱导量为终浓度0.5％。

抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达

目的用毕赤酵母构建抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并使随机多肽在培养基中表达。方法用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168中,形成突变库。利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE鉴定表达蛋白质。结果肽库库容达到7.8×103个cfu,在上清中鉴定出了表达蛋白。结论成功构建了抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并实现了在培养基上清中的表达。

抗菌肽DCD-1L在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的:利用大肠杆菌表达系统表达抗菌肽DCD-1L并鉴定其抑菌活性。方法:根据DCD-1L氨基酸序列以及大肠杆菌密码子偏爱性设计出DCD-1L的基因序列,通过重叠延伸PCR扩增出完整的DCD-1L编码序列,接着用酶切,连接,转化等方法获得重组表达载体pET-32a-DCD-1L,并将其进行PCR,酶切及测序鉴定。将鉴定正确的重组体转化E.coli transetta菌株,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达后,用SDS-PAGE分析目的蛋白表达状况,并用抑菌圈实验检测其抑菌活性。结果:SDS-PAGE检测DCD-1L在28KDa处有目的条带,抑菌圈实验结果显示DCD-1L对地衣芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,绿脓杆菌以及肺炎链球菌均有明显的抑菌活性。结论:成功构建重组表达载体pET-32a-DCD-1L并在E.coli transetta菌株中成功表达,获得了对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌活性的抗菌肽DCD-1L。