应用MALDI-TOFMS检测5种白血病细胞株DCK和CDA基因部分单核苷酸多态性

目的:检测5种白血病细胞株中脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,DCK)和胞苷脱氨酶(cytidine deaminase,CDA)基因的单核苷酸多态性。方法:培养人红白血病细胞株K562,人慢性粒细胞白血病细胞株Ka,人急性髓系白血病细胞株HL-60、U937,人Burkkit淋巴瘤细胞株Raji。采用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取基因组DNA,设计引物,PCR扩增相应目的片段,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOFMS)检测DCK基因A674G(rs111454937)、C1644T(rs72552079),CDA基因A79C(rs2072671)、G208A(rs60369023)的单核苷酸多态性。结果:5种细胞株DCK基因A674G(rs111454937)均为A/A纯合子型,C1644T(rs72552079)均为C/C纯合子型。HL-60、U937、Raji细胞株CDA基因A79C(rs2072671)为A/A纯合子,K562、Ka细胞株为C/A杂合子;5种细胞株CDA基因G208A(rs60369023)均为G/G纯合子型。结论:CDA基因的A79C(rs2072671)SNPs位点基因型在5株血液系统肿瘤细胞株中不尽相同,余所测3个SNPs位点基因型在各细胞株中均相同。

阿糖胞苷代谢关键酶基因在儿童恶性血液肿瘤中的表达

目的通过检测儿童急性白血病(AL)及非霍奇金淋巴瘤(NHL)骨髓细胞内阿糖胞苷(Ara-C)代谢关键酶———脱氧胞苷激酶(DCK)和胞苷脱氨酶(CDA)的基因表达及酶活性水平,探索DCK和CDA表达与临床疗效的关系。方法共计31例患儿,其中初诊27例(ALL20例,AML3例,NHL4例),复发4例(ALL2例,AML、NHL各1例),采集患儿骨髓细胞,采用荧光定量PCR检测细胞内DCK、CDA基因表达,核素液闪法检测细胞内DCK、CDA酶活性,统计分析各组患儿的检测结果。结果 (1)DCK:ALL和NHL患儿DCK mRNA与酶活性水平均明显高于AML患儿(P<0.05);初治患儿均明显高于复发患儿(P<0.05);(2)CDA:AML和复发患儿的CDA酶活性水平明显高于ALL、NHL和初治患儿(P<0.05),但各组病例间的CDA mRNA表达差异无显著性(P>0.05)。(3)DCK和CDAmRNA表达与酶活性水平呈高度正相关。结论 AML以及某些复发的血液肿瘤患儿,其总体DCK酶活性及基因表达水平降低,CDA酶活性水平增高。DCK和CDA酶活性可能与儿童恶性血液肿瘤疗效相关。

长期传代后HL-60细胞内脱氧胞苷激酶与阿糖胞苷耐药性的关系

目的通过观察人早幼粒白血病细胞系(HL-60)及其耐药细胞株(HL-60/R)经过长期传代后细胞内脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase,dck)mRNA表达及其酶活性的变化规律,探讨dck与阿糖胞苷(Ara-C)疗效及耐药现象发生的相关性。方法分别采用实时PCR方法和核素液闪法测定HL-60和HL-60/R细胞内dck的mRNA表达水平及其酶活性水平。通过体外培养传代,观察2种细胞株经长期传代(5、10、20、30、40、50代)后细胞内dck的mRNA表达及酶活性的变化规律。结果传代初期结果显示,HL-60和HL-60/R两组细胞株之间的mRNA表达水平分别为0.37±0.03和0.17±0.03,活性值分别为0.069±0.006nmol.min-1.mg-1 protein和0.019±0.007nmol.min-1.mg-1 protein,HL-60的dck mRNA表达水平和酶活性均明显高于HL-60/R(P<0.01)。并且两组细胞株之间的显著性差异(P<0.01)持续存在于各传代过程中。HL-60和HL-60/R两组各传代节点(10、20、30、40和50代)的dck mRNA表达水平与酶活性与本组第5代细胞相比,则无明显变化(P>0.05)。结论 HL-60及HL-60/R两组细胞株间的dck mRNA表达和酶活性在传代初期存在显著差异,且两组间的差异持续存在。但与各自的初期传代相比,长期传代后的dck mRNA表达和酶活性变化并不明显,提示dck仅与Ara-C的初期疗效明显相关,而与Ara-C耐药现象的发生可能无关。

脱氧胞苷激酶Ser-74位点在辐射诱导的乳腺癌细胞死亡中的作用

目的研究脱氧胞苷激酶（dCK）S74位点在辐射诱导乳腺癌细胞MCF-7死亡中的作用。方法采用脂质体转染方法在MCF-7中分别构建dCK—Vector（空载体）、dCK—WT（野生型）、dCK-S74A（非磷酸化型）及dCK-S74E（过磷酸化型）4种细胞模型，均分别予以0，2，4，6和8GyX射线照射。实时定量PCR（QPCR）及Westernblot验证细胞模型，CCK-8法和集落形成实验检测细胞存活率，单丹磺酰尸胺（MDC）检测自噬发生率，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果成功构建4种细胞模型；CCK_8结果显示，与0Gy组相比，MCF-7和dCK—Vector经8Gy照射后存活率下降（t=14．469和9．357，P〈0．05），dCK-WT、dCK-S74E和dCK-S74A没有改变（P〉0．05）；与dCK-Vector比较，dCK-wT和dCK．$74E照射后的总死亡率降低（X2=3．857～3．971和3．857—3．859，P〈0．05），dCK-S74A则没有变化（P〉0．05）；与各自0Gy组比较，MCF7、dCK—Vector和dCK-S74A照射后凋亡发生率升高（t=-4．531、-3．688和-7．076，P〈0．05），而dCK—wT和dCK-S74E使照射诱导的凋亡率逆转了66％和68％；dCK—wT和dCK-S74E照射后自噬率分别增加22％和26％（f=-9．051和-8．411，P〈0．01），dCK-S74A、MCF-7和dCK—Vector照射后的自噬率没有明显变化（P〉0．05）。结论riCK-WT和dCK-S74E使电离辐射诱导的凋亡率增加发生逆转，同时使自噬率增加，总死亡率降低，提示dCK在Ser．74的磷酸化与乳腺癌细胞MCF-7的辐射敏感性有关。