DcR3、ALT与AFP联合检测对肝细胞癌的诊断价值

探讨血清诱骗受体3(decoy receptor,DcR3)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein ,AFP)联合检测对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的临床诊断价值。 方法 选取127例临床诊断为HCC的患者作为研究对象(HCC组)。采用ELISA检测DcR3,全自动生化分析检测ALT、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),γ-谷氨酰胺转移酶(γ–glutamyl transpeptidase,γ-GGT)), 总蛋白(Total protein,TP),白蛋白(AlbuminALB)及AFP化学发光法测定的水平。采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析DcR3及相关实验室指标对HCC患者的诊断价值。比较两组间的差异采用t检验,P<0.05认为统计有统计学意义。 结果 HCC 组中的临床指标DcR3、AFP 、ALT、AST、GGT的检测水平明显高于对照组(P < 0.01),而HCC 组的TP、ALB水平较低(P < 0.01)。DcR3、ALT和AFP联合检测对HCC的诊断灵敏度为96.3%,而单项检测的诊断敏感性分别为85.2%、92.6%和81.5%。 结论DcR3、ALT和AFP联合检测提高了HCC的诊断敏感性,升高的DcR3对HCC可能具有很重要的诊断价值。

DcR3及其配体的研究进展

DcR3/TR6是最近发现的可溶性TNFR超家族成员,在归类上属于第三类,其配体具有多样性。它可竞争性地与FasL、LIGHT及,TL1A结合,在肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都发挥着重要的作用。本文拟就DcR3及其配体的研究进展作一综述。

肝癌发展中FasL及其受体Fas/DcR3的表达分析

目的研究小鼠肿瘤发生早期肿瘤坏死因子超家族成员FasL及其受体的表达特点,及其与免疫调节相关分子表达的时空关系,探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法建立小鼠实体瘤模型,采用RT-PCR方法检测肿瘤组织中可溶型FasL、Fas及DcR3、TGF-β、IL-10在肿瘤发生不同时相的表达,同时,应用ELISA方法定量检测血清中TGF-β、IL-10的表达。结果在早期的肿瘤组织中,Fas的表达先于DcR3,其后DcR3大量表达,而Fas的表达则下调直至丢失,DcR3、FasL同时表达并上调,TGF-β和IL-10也随肿瘤的表达而上调。TGF-β同DcR3的表达具有空间位置的一致性。FasL、DcR3、TGF-β和IL-10的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节,FasL、DcR3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中可能发挥着重要作用。

结肠癌患者外周血DcR3与CEA联合测定的临床价值

目的联合检测结肠癌患者外周血中DcR3与癌胚抗原(CEA)mRNA的水平,建立取材于外周血的早期诊断结肠癌的新方法。方法44例结肠癌患者和30名健康志愿者,各取5 mL静脉血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离外周血单核细胞,细胞总RNA TRIzol提取液提取外周血单核细胞总RNA,用半定量RT PCR法检测外周血单核细胞中DcR3与CEA mRNA的水平,并用t检验进行比较。结果结肠癌患者外周血中DcR3基因的相对表达水平为0.415±0.078,与健康对照组(0.235±0.074)比较有显著性差异(P<0.05),但患者之间没有明显差异(P>0.05)。CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44),表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者均为阴性。结论DcR3基因在结肠癌患者外周血中表达水平明显高于健康人,其表达水平与结肠癌有相关性。在CEA阴性情况下,DcR3可能成为新的肿瘤标志物。

抗人DcR3单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的制备抗DcR3单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性,并应用于ELISA、Western blot、Flowcytometry(FCM)检测。方法以纯化的可溶性DcR3(sDcR3)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DcR3 mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DcR3mAb的亚类。用ELISA方法测定抗DcR3 mAb与sDcR3结合的特性,SDS-PAGE鉴定抗DcR3 mAb与SW480细胞上清中DcR3结合的特性,以鉴定mAb的特性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。Western blot检测mAb的特异性及应用,并用所获抗DcR3单克隆抗体(mAb)通过流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DcR3的表达水平。结果获得4株可分泌DcR3 mAb的杂交瘤细胞系ZZ-393、ZZ-394、ZZ-151和ZZ-268。其中DcR3 mAb ZZ-268(下文简称为ZZ-268)的Ig亚类为IgG1(κ型);腹水效价为1×10-5;亲和常数为1.28×109水平;ZZ-268和ZZ-151可识别与其他2种抗体不同的抗原表位;Western blot证实,获得的ZZ-268可特异性地识别DcR3;通过流式细胞术可敏感地检测到不同肿瘤细胞表面DcR3的表达水平。结论获得4株抗DcR3的mAb,其中ZZ-268效价高、特异性强,将此抗体用于膜DcR3与sDcR3的检测分析。

结肠癌中DcR3和livin表达与预后的关系

目的探讨DcR3和livin在结肠癌组织中的表达与预后的关系。方法采用二步法免疫组化技术(Envision),检测62例术前未经化疗的结肠癌组织中DcR3和livin基因的表达情况。结果 62例结肠癌组织中DcR3阳性表达率56.5%(35/62);而livin阳性率48.4%(30/62)。DcR3和livin表达与结肠癌组织学类型、浸润深度、临床分期和淋巴结转移有明显相关性(P<0.05);与患者年龄、性别、肿瘤大小等无关(P>0.05)。DcR3在livin阳性和阴性患者中阳性率分别为68.6%(24/35)和22.2%(6/27),两者差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌DcR3和livin均阴性表达病例的5年生存率高于DcR3和livin均阳性表达者,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DcR3和livin异常表达可促进结肠癌的发生发展,同时两者具有协同作用,其与肿瘤的恶性程度与生存率有关;联合检测DcR3和livin更有助于判断结肠癌的发展趋势,为临床诊治及判断预后提供新的路径。

DcR3重组蛋白对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关分子的表达及细胞凋亡的作用

目的:研究诱骗受体3(DcR3)在正常大鼠、糖尿病(DM)大鼠心肌组织的表达,DcR3重组蛋白对心肌组织凋亡相关分子表达以及心肌细胞凋亡的影响,探讨DcR3对DM大鼠心肌细胞凋亡的作用。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,尾静脉注射不同剂量的DcR3重组蛋白[1.2 mg/(鼠·d)、0.8 mg/(鼠·d)、0.4 mg/(鼠·d)]40 d。RTPCR检测心肌组织DcR3 mRNA、Fas mRNA、FasL mRNA的表达。Wester blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-8的表达。双抗夹心ELISA检测血液中IL-1β、TNF-α及LFN-γ水平的变化,HE染色观察心肌细胞凋亡的百分率。结果:DcR3治疗组大鼠与DM组比较心肌组织DcR3 mRNA高表达,Fas mRNA、FasL mRNA表达下调。Caspase-8蛋白水平下调,Bcl-2蛋白水平上调,以中剂量组的作用最明显。各DcR3治疗组血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01)。心肌细胞凋亡的百分率下降(P<0.05)。结论:DcR3重组蛋白有抑制DM大鼠心肌细胞凋亡的作用,其机制与竞争Fas,阻断FasL诱导细胞凋亡,心肌细胞表达DcR3,凋亡相关因子Caspase-8下调、Bcl-2上调及细胞因子水平的降低有关。

血清HIF-1α、DcR3、TSGF在宫颈癌诊断中的作用及其与患者临床病理参数的关系

目的观察血清缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、诱骗受体3(DcR3)、恶性肿瘤特异生长因子(TSGF)在宫颈癌诊断中的作用,并探讨其与患者临床病理参数的关系。方法选取体检女性2 250例,根据体检及病理诊断结果分为健康组1 342例、宫颈良性病变组836例、宫颈癌组72例。采用ELISA法检测三组血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价三者单独及联合诊断宫颈癌的价值,比较不同临床病理参数的宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平。结果宫颈癌组血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均高于宫颈良性病变组、健康组(P均<0.05)。血清HIF-1α、DcR3、TSGF联合诊断诊断宫颈癌的AUC(0.891)高于三者单独诊断的AUC(0.791、0.812、0.789)。血清HIF-1α、DcR3、TSGF单独诊断宫颈癌的截断值分别为172.38 pg/mL、492.70 pg/mL、65.51 U/mL,灵敏度分别为68.06%、75.00%、69.44%,特异度分别为81.82%、78.61%、80.85%,三者联合诊断宫颈癌的灵敏度、特异度分别为75.00%、86.74%。FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、组织学低分化、宫颈浸润深度≥2/3的宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、组织学中高分化、宫颈浸润深度<2/3者(P均<0.05)。不同年龄、肿瘤直径患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均升高,三者联合检测有助于宫颈癌的诊断及病情评估。

PTEN、Fas/FasL和DCR3在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:研究PTEN、Fas/FasL和DCR3在人胃癌组织中的表达,初步探讨三者与胃癌的发生、癌细胞增殖和侵袭转移的关系及其临床意义。方法:采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法检测75例胃癌标本黏膜组织中PTEN、Fas/FasL和DCR3蛋白的表达,15例胃溃疡或十二指肠溃疡患者胃黏膜组织作为正常对照组。结果:胃癌组织中DCR3的表达率显著高于正常胃黏膜组织,PTEN及Fas/FasL的表达率则低于正常胃黏膜组织,差异均有统计学意义(P<0.01);DCR3与Fas/FasL、PTEN的表达呈负相关(P<0.001),PTEN与Fas/FasL的表达呈正相关(P<0.001,r=0.401),三者的阳性表达率与肿瘤淋巴转移、临床分期、肿瘤病理分化程度及浸润深度密切相关,与性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。结论:DCR3、PTEN及Fas/FasL在胃癌的发生发展及浸润转移中存在着相互制约的关系。检测三者在胃癌中的表达,有助于从不同角度判断胃癌的恶性生物学行为;DCR3、PTEN及Fas/FasL有可能成为胃癌临床诊断、判断疗效及监测预后的可靠指标。

DcR3 mRNA在白血病细胞中的表达及意义

目的:探讨DcR3 mRNA在急性白血病(AL)细胞中的表达及其临床意义。方法:选择AL患者46例,其中急性髓系白血病(AML)28例,急性淋巴细胞白血病(ALL)18例,27例非恶性血液病患者作为对照组,采用RT-PCR方法检测骨髓单个核细胞(BMNC)中DcR3 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的关联性。结果:AL组DcR3 mRNA表达阳性率(67.4%)及表达水平(0.56±0.09)高于对照组(40.7%,0.39±0.19)(P<0.05);AML组DcR3 mRNA表达阳性率(71.4%)及表达水平(0.56±0.09)与ALL组(61.1%,0.53±0.08)比较差异无显著性(P>0.05);AL患者DcR3 mRNA的阳性表达率在白细胞计数≥30×109.L-1时升高。结论:DcR3基因可能通过抑制白血病细胞凋亡途径参与白血病发病过程。

胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及临床意义

目的探讨胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测50例胃癌组织及其对应的50例正常胃黏膜中Survivin、DcR3 mRNA的表达情况。结果胃癌中Survivin、DcR3 mRNA的阳性表达率均明显高于正常胃黏膜组织(均P<0.01),二者的表达水平在胃癌中呈正相关(P<0.01);Survivin、DcR3 mRNA的表达水平均与胃癌的组织分化程度、淋巴转移、TNM分期有关(均P<0.05)。结论联合检测Survivin和DcR3有助于判断胃癌预后,可能是临床评价胃癌恶性程度的重要指标。

RA患者外周血DcR3表达水平与疾病活动性相关分析

目的探讨DcR3在类风湿性关节炎(RA)发病过程中表达水平的变化及其与疾病活动性关系。方法选择39例RA患者为实验组,26例健康体检者为对照组,采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测RA患者外周血单个核细胞DcR3mRNA的基因表达水平,采用ELISA法检测患者血清中DcR3、IL-4和IFN-γ水平,并将检测结果与DAS28评分进行相关性分析。结果活动期RA患者PBMC中DcR3mRNA表达水平高于缓解期RA患者和健康对照组,差异有显著性(P<0.05);活动期RA患者血清DcR3和IFN-γ水平显著高于缓解期RA患者和健康对照组(P均<0.01);IFN-γ/IL-4比值显示,活动期RA患者显著高于健康对照组和缓解期RA患者(P均<0.01);RA患者外周血DcR3mRNA水平和血清IFN-γ/IL-4比值与DAS28评分呈显著正相关趋势。结论活动期RA患者外周血DcR3蛋白与PBMC中DcR3mRNA表达水平显著升高,可能通过促Th2等作用参与RA的发生发展,与疾病的活动性密切相关。

宫颈癌组织中DCR3表达与外周血T细胞亚群的相关性研究

目的探讨宫颈癌组织中诱骗受体3(DCR3)表达与外周血T细胞亚群之间的相关性。方法免疫组织化学法检测宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌(CC)及正常宫颈组织中DCR3表达情况,并检测宫颈癌组织中实质及间质内T细胞表面抗原CD3、CD4、CD8阳性细胞数量;应用流式细胞术分析患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+T数量变化情况,分析研究宫颈癌组织中DCR3表达与患者外周血T细胞亚群之间的相关性。结果 DCR3表达强度与宫颈病变严重程度有关;宫颈癌患者外周血中T细胞数明显降低,且宫颈组织中DCR3表达与患者外周血中CD3+T、CD4+/CD8+呈负相关;宫颈癌变后实质内T细胞数明显减少,T细胞主要聚集于肿瘤间质内。结论 DCR3参与了宫颈癌细胞免疫逃逸,外周血T细胞亚群联合DCR3检测可作为宫颈癌免疫诊断指标,为患者免疫治疗提供基础。

浆液性卵巢肿瘤组织中DCR3、Survivin、PDCD5的表达

目的:探讨DCR3、Survivin、PDCD5凋亡相关基因在浆液性卵巢肿瘤组织中的表达。方法:采用免疫组化及Real-time PCR两种方法观察浆液性囊腺瘤16例、交界性浆液性囊腺瘤25例、浆液性囊腺癌48例组织中DCR3、Survivin、PDCD5的蛋白及mRNA表达。结果:DCR3、Survivin、PDCD5在卵巢浆液性囊腺瘤组织的细胞浆或核未见明显的棕黄色颗粒沉着,而在交界性浆液性囊腺瘤组织的细胞浆或核中可见弱的棕黄色颗粒沉着,浆液性囊腺癌可见强的棕黄色颗粒沉着。与卵巢浆液性囊腺瘤组相比,交界性浆液性囊腺瘤、浆液性囊腺癌中DCR3、Survivin、PDCD5 mRNA表达水平显著增高(P<0.05)。结论:DCR3、Survivin、PDCD5凋亡相关基因在浆液性卵巢肿瘤中的蛋白及mRNA表达变化呈一致升高的趋势,其机制可能与调控凋亡有关,进而参与了卵巢肿瘤的发生发展过程,并可为卵巢肿瘤的防治提供一些新策略。

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b(+)/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。

RNAi抑制结肠癌细胞系DcR3的表达及对癌细胞生长的影响

目的:观察抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.方法:应用RNA干扰(RNAi)技术,构建小双链DNA,克隆入表达载体,转染进入SW480结肠癌细胞系(DcR3高表达细胞),在细胞内形成小干扰双链RNA;识别并降解DcR3 mRNA.筛选DcR3低表达转染癌细胞,观测其体外DcR3-SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.结果:与对照组相比,转染DcR3-RNAi(F1R1)的WS480细胞,DcR3 mRNA的表达明显降低,各组相比,加入DcR3-RNAi(F1R1)组的SW480细胞数量明显减少,而仅加入DcR3及对照组细胞数量明显增加.统计学处理差异显著(P<0.001).与对照组相比,经DcR3-RNAi处理组凋亡抗体Caspase3及PARP产物表达增加.结论:经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低.肿瘤细胞的生长数量减少,凋亡增加,有一定可探索性抗癌前景.

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的：制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb），并鉴定其特异性。方法：纯化的His．DcR3融合蛋白免疫小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化，纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价。结果：获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞，均属IgG1亚型，其腹水抗体效价为1×10^-5～1×10^-7，Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白，其中1株（181）可与SW480细胞成分反应。结论：成功建立稳定分泌抗人DcR3mAb的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体特异性强、效价高，为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。

DcR3在预防博莱霉素大鼠模型发生肺纤维化中的作用

目的探讨DcR3在预防博莱霉素大鼠模型发生肺纤维化中的作用。方法采用博莱霉素复制肺纤维化动物模型。分为正常对照组、博莱霉素组、博莱霉素+DcR3组,给药时间2 w,各组分别于2、4、6、8 w处死大鼠6只,收集肺泡灌洗液的细胞和上清检测细胞因子含量。左肺组织冻存留作羟脯氨酸检测;右肺组织固定用作组织染色。结果博莱霉素+DcR3组肺泡炎的程度表现为逐渐减轻的过程,炎症程度均低于BL组(P<0.05);BL+DcR3组肺纤维化程度无明显加重趋势,与对照组比较差异显著(P<0.05),与BL组比较有显著性差异(P<0.01)。结论 DcR3的早期应用,可减轻博莱霉素大鼠模型肺的的局部炎症,可能在一定程度上达到预防肺纤维化形成的目的。

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。