Ddx1基因在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的表达

目的系统观察不同日龄小鼠睾丸组织的发育特点,检测ddx1基因与蛋白在不同发育阶段小鼠睾丸组织中的表达模式,探讨ddx1基因在精子发生过程中的作用。方法采用石蜡切片HE染色的方法观察不同发育阶段小鼠睾丸组织的结构特征;采用实时荧光定量PCR法检测ddx1mRNA在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达;采用免疫印迹和免疫组织化学法检测DDX1蛋白在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达特性与细胞内的定位。结果石蜡切片HE染色显示5、15、23、35、42和60日龄小鼠睾丸组织结构特点能代表生精上皮组织发生发育阶段;实时荧光定量PCR法显示ddx1mRNA在各日龄小鼠睾丸组织中均有表达,于15日龄开始增高,随后维持稳定水平;免疫印迹法显示DDX1蛋白在35、42、60日龄小鼠睾丸组织中特异性表达并逐渐增高;免疫组织化学法显示在少量精原细胞、大量精母细胞和圆形精子细胞胞质与细胞核中存在DDX1蛋白阳性表达。结论 Ddx1基因和蛋白在小鼠精子发生过程中呈现阶段与细胞特异性表达,提示ddx1基因可能在精子发生过程中发挥作用。

DDX1基因在神经母细胞瘤中的表达

目的检测神经母细胞瘤（NB）临床标本中瘤组织及瘤旁组织中deadbox1（DDX1）基因的表达，探讨DDX1基因与NB的关系。方法选取2012年1月至2014年12月新乡医学院第一附属医院病理科收集的5例NB患儿病理标本。其中男3例，女2例；年龄1～5岁，平均年龄（2．1±1．6）岁。5例NB患儿的瘤组织及瘤旁组织（瘤旁组织为至少距离瘤组织2cm的非瘤组织）固定于40g／L的甲醛溶液中，然后进行常规脱水、包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、滴加一抗、二抗、二氨基联苯胺（DAB）显色，光镜下观察瘤组织及瘤旁组织中DDX1的表达，并进行半定量分析。1．染色程度：不着色记为0分；着色浅记为1分；着色适中记为2分；着色深则记为3分。2．阳性细胞比例：阳性细胞比例〈10％记为0分；阳性细胞比例为10％-30％记为1分；阳性细胞比例为31％-60％记为2分；阳性细胞比例〉61％记为3分。最终评分为（染色程度评分＋阳性细胞比例评分）／2，若最终评分为0—1．0则记为“-”，1．1～2．0记为“＋”，2．1—3．0记为“＋＋”，3．1—5．0记为“＋＋＋”。结果DDX1在NB及其瘤旁组织中均有表达，但在NB组织中肉眼可见的DDX1阳性着色数目更多、更深，而瘤旁组织中DDX1的阳性着色明显少，且着色浅。5例瘤旁组织免疫组织化学的半定量评分均为阴性，且最终评分均≤1．0分，平均0．5分，而瘤组织中DDX1的半定量评分均为“＋”或“＋＋”，且最终评分均≥1．5分，平均1．8分，NB组织中DDX1的表达明显高于瘤旁组织。结论DDX1在NB组织中呈高表达，可能促进了NB的发生发展。这表明DDX1可能作为一个癌基因，在NB的发生发展中起到促进作用，为后续研究提供了临床证据支撑。

RNA干扰沉默DDX1基因的胶质瘤细胞系的建立

目的以短发夹核糖核酸(RNA)慢病毒载体建立DEAD-box解旋酶1(DDX1)基因稳定沉默的胶质母细胞瘤细胞株。方法针对DDX1基因设计2组短发夹RNA序列,退火形成的双链DNA与线性p LKO. 1-puro-e GFP质粒载体连接,构建慢病毒质粒载体,测序正确后进行慢病毒包装;将获得的重组慢病毒转染人胶质瘤U251细胞,转染细胞分为对照组和干扰组,对照组转染对照慢病毒(sh NC);干扰组转染慢病毒载体p LKO. 1-puro-e GFP-shRNA-DDX1(sh DDX1-1,sh DDX1-2)。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,进行嘌呤霉素抗性筛选;用实时定量聚合酶链式反应(PCR)、蛋白免疫印迹法检测转染后U251细胞中DDX1 mRNA及蛋白表达。结果测序证实成功构建对照组和靶向DDX1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,病毒悬液滴度均> 3×10~8TU·m L^(-1)。荧光显微镜下观察显示,对照组和干扰组转染效率高于85%;嘌呤霉素筛选后,干扰组sh DDX1-1、sh DDX1-2中DDX1 mRNA的抑制率分别为85. 44%和71. 66%,DDX1蛋白表达水平分别下降了99. 1%和96. 7%,均较对照组(100%)显著降低(均P <0. 01)。结论成功构建沉默DDX 1基因的胶质瘤细胞系,为研究DDX1对胶质瘤生物学行为的影响提供细胞模型。

DDX1基因对神经母细胞瘤细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响

目的 探讨dead box 1（DDX1）基因对神经母细胞瘤（NB）细胞侵袭、迁移及耐药能力的影响。 方法 根据病毒滴度在2孔细胞中分别加入适宜量的目的病毒（Lenti-DDX1-MIR病毒液，滴度1012 TU/L）和阴性对照病毒（Lenti-EGFP病毒液，滴度3×1011 TU/L）[感染复数（MOI）＝10]。将生长状态良好、处于对数生长期的空细胞[SK-N-BE（2）/blank]、阴性对照组细胞[SK-N-BE（2）/shV]和干扰DDX1组[SK-N-BE（2）/shDDX1]细胞进行培养。用Transwell法检测细胞侵袭能力，并用结晶紫对细胞进行染色，每个小室选取5个视野计数，取平均值计算细胞的侵袭率。用Transwell法检测细胞迁移能力，并用结晶紫对细胞进行染色，用酶标仪检测570 nm处的吸光度值，然后计算细胞迁移能力。称取50 mg顺铂，用5 mL二甲基亚砜（DMSO）溶剂溶解配制成质量浓度为10 g/L的母液备用；称取50 mg多柔比星，用PBS溶剂溶解配制成质量浓度为1 g/L的母液备用。将药物加入细胞培养板，达到终浓度，其中多柔比星终质量浓度为1.0 mg/L，顺铂终质量浓度为2.5 mg/L，药物处理24 h，然后拍照记录。CCK-8检测细胞对多柔比星和顺铂的敏感性变化。 结果 Transwell实验结果显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞侵袭的细胞量只有SK-N-BE（2）/blank及SK-N-BE（2）/shV细胞的60%；结晶紫染色显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的侵袭能力弱于SK-N-BE（2）/blank细胞及SK-N-BE（2）/shV细胞的侵袭能力，即DDX1敲减后SK-N-BE（2）细胞的侵袭能力减弱。Transwell实验结果显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的迁移能力只有SK-N-BE（2）/blank及SK-N-BE（2）/shV细胞的50%；结晶紫染色显示，SK-N-BE（2）/shDDX1细胞的迁移能力弱于SK-N-BE（2）/blank细胞及SK-N-BE（2）/shV细胞的迁移能力，即DDX1敲减后SK-N-BE（2）细胞的迁移能力减弱。DDX1基因敲减后，1.0 mg/L的多柔比星对SK-N-BE（2）/shDDX1细胞24 h的抑制率为SK-N-BE（2）/shV细胞的1.93倍，2.5 mg/L的顺铂对SK-N-BE（2）/shDDX1细胞24 h的抑制率为SK-N-BE（2）/shV细胞的1.38倍。DDX1基因表达降低能显著提高NB细胞对顺铂和多柔比星的药物敏感性。 结论 DDX1的表达受到抑制后，NB细胞侵袭、迁移能力均减弱，NB细胞对多柔比星和顺铂的药物敏感性增加，NB细胞的耐药能力减弱。

DDX1基因下调对宫颈鳞癌SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨下调DEAD-box解旋酶1(DDX1)基因对宫颈鳞癌Si Ha细胞增殖、凋亡、转移及侵袭能力的影响。方法:si RNA转染构建DDX1低表达Si Ha细胞系、和阴性对照组,用RT-qPCR和Westem Blot检测DDX1的m RNA和蛋白表达水平。应用CCK8法、流式细胞技术、Transwell实验分别检测DDX1低表达对Si Ha细胞增殖、凋亡、转移和侵袭能力的影响。结果:(1)m RNA水平检测显示:下调DDX1,Si-DDX1组中DDX1表达均低于Si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。蛋白水平检测显示,Si-DDX1组中DDX1表达低于Si-NC组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)下调DDX1后,Si-DDX1组细胞的增殖活性较Si-NC组升高,Si-DDX1组的凋亡率较Si-NC组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)下调DDX1后,Si-DDX1组细胞转移率和侵袭率均较Si-NC组增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DDX1的表达受到抑制后,宫颈鳞癌Si Ha细胞的增殖能力增强、凋亡能力减弱,转移和侵袭能力增强。