老年胃癌患者DEAD-box蛋白家族RNA解旋酶3的表达及临床意义

目的研究老年胃癌患者DEAD-box蛋白家族RNA解旋酶3(DDX3)的表达情况,分析其表达与临床病理参数的相关性。方法选择70例经病理证实的老年胃癌患者,采集胃癌组织和癌旁组织标本,分别采用免疫组化法和RT-PCR法检测DDX3蛋白及mRNA,分析DDX3的表达与病理参数的相关性。结果 DDX3蛋白在胃癌组织中的阳性表达率(51.4%)高于癌旁组织(8.6%),差异有显著性(χ~2=30.6122,P=0.000)。DDX3 mRNA表达吸光度值(1.48±0.19)高于癌旁组织(1.05±0.23),差异有显著性(t=11.8809,P=0.000)。胃癌分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度及是否存在淋巴结转移与DDX3表达阳性率有关,胃癌低分化、临床分期Ⅲ～Ⅳ期及出现淋巴结转移者DDX3表达阳性率较高。DDX3 mRNA的表达与胃癌分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度及是否存在淋巴结转移显著相关(P<0.05)。结论 DDX3的高表达与老年胃癌的发生、发展相关。

RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤的相关性研究

RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的家族,是基因表达的重要调控因子,在RNA代谢的多个方面发挥作用。RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族既在RNA代谢中具有重要作用,又与人类细胞中基因组的不稳定性直接相关。而基因组的不稳定性是癌症克隆进化的驱动因素,能够促进癌症的发生发展。该文对RNA解旋酶DEAD-box蛋白家族与肿瘤发生发展的相关性做一综述。

DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用

旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。

番茄DEAD-box RNA解旋酶基因SlDEAH1的克隆及表达分析

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄(Solanum lycopersicum)AC++中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明:SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA3、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。

猪瘟病毒NS3蛋白ATPase/RNA解旋酶功能区的表达与纯化

采用RT-PCR技术扩增出猪瘟病毒石门株和C株NS3基因的ATPase/RNA解旋酶功能区,将其克隆到表达载体pET-28a(+)中,获得重组质粒pET-NS3SM和pET-NS3C;PCR、酶切鉴定和序列分析结果表明目的基因插入位置、方向和读码框完全正确;0.8 mmol/L IPTG诱导得到分子量为54kD的目的蛋白,Western blotting结果表明,表达的目的蛋白与猪瘟高免血清没有出现肉眼可见的反应;通过ELISA试验结果表明,重组蛋白能被CSFV阳性血清识别。

RNA解旋酶DDX3与转移性乳腺癌预后关系的研究

目的探讨RNA解旋酶DDX3与转移性乳腺癌预后的关系。方法收集2010年1月至2012年12月间就诊金华市中心医院确诊为转移性乳腺癌(Ⅳ期)的患者共83例,经RT-PCR技术检测术后癌组织及癌旁组织RNA解旋酶DDX3的表达情况,分析其与转移性乳腺癌患者术后生存状况的关系。结果通过RT-PCR检测结果显示,RNA解旋酶DDX3在转移性乳腺癌组织中的表达(0.49±0.06)显著高于癌旁组织的表达量(0.23±0.02)(t=4.956,P<0.05)。同时,RNA解旋酶DDX3在转移部位、转移部位数、雌激素受体/孕激素受体(ER/PR)状态临床因素中表达存在明显差异(t/F值分别为8.013、9.227、8.246,均P<0.05),而在年龄、是否绝经、癌组织类型临床因素中不存在明显差异(t/F值分别为1.432、0.914、1.107,均P>0.05)。DDX3的表达水平≥0.45在术后3年的复发率明显高于其表达水平<0.45者(χ2=8.121,P<0.05)。同时,DDX3的表达水平≥0.45者的平均复发时间也短于其表达水平<0.45者,两组差异均具有统计学意义(t=7.235,P<0.05)。利用Cox风险回归模型分析结果显示,转移部位、转移部位数、DDX3的表达量是转移性乳腺癌术后预后的独立危险因素(OR值分别为1.427、1.203、2.886,均P<0.05),术后辅助放化疗是保护因素(OR=0.779,P<0.05)。结论 RNA解旋酶DDX3是转移性乳腺癌患者术后预后的影响因素,通过对RNA解旋酶DDX3的检测可为转移性乳腺癌患者临床诊治提供一定的参考价值。

玉米DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆及分析

DEAD-box RNA解旋酶参与RNA转录、前体mRNA剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解等重要的生命活动.根据本室在S-Mo17Rf3Rf3cDNA芯片研究中,检测到花粉发育后期RNA解旋酶上调表达的结果,应用RACE技术从S-Mo17Rf3Rf3花粉中克隆得到该RNA解旋酶基因全长cDNA,命名为ZmRH2并在GenBank注册登记(DQ327709).序列分析表明该cDNA全长1652bp,从第163bp开始到1386bp含有一个开放阅读框,编码407个氨基酸.其编码的蛋白质具有DEAD-boxRNA解旋酶特有的9个保守模体,与水稻、拟南芥和豌豆中的DEAD-boxRNA解旋酶的氨基酸序列存在着很高的同源性.RT-PCR分析表明,该基因在近等基因系S-Mo17Rf3Rf3和S-Mo17rf3rf3的叶、根、和雌穗中的表达没有差异,但在花丝和花粉中有明显差异.

HIV-1 Rev蛋白和人DDX3解旋酶对HCV RNA复制影响

目的研究人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)和DEAD-box蛋白家族ATP依赖的RNA解旋酶3(DDX3)对HCV RNA复制的影响。方法利用HCV表达质粒p CDNA3.1-JFH1转染Huh7细胞以构建稳定的HCV细胞复制模型,另构建p CDNA3.1-Rev-Flag-m Cherry和p CDNA3.1-DDX3-YFP-Flag的过表达载体,通过PCR、Western blot和核苷酸测序等方法鉴定载体构建成功后,将实验分为2组对照实验,对照组均只将HCV复制质粒转染Huh7细胞:1组实验组为DDX3和HCV RNA复制质粒共转染入Huh7细胞;2组的实验组为Rev、DDX3和HCV RNA复制质粒共转染入Huh7细胞。最后通过q PCR定量测定各组HCV RNA复制水平并进行比较。结果转染后48 h测各组HCV RNA的复制水平,DDX3+HCV RNA复制质粒组中HCV RNA的水平(1.09×107±0.18×107)明显高于单独转染HCV RNA复制质粒组(4.79×106±1.24×106)(P=0.03);而Rev+DDX3+HCV RNA复制质粒组中HCV RNA的水平(1.74×107±0.40×107)明显低于单独转染HCV RNA复制质粒组(4.17×107±0.46×107)(P<0.001)。结论成功构建Rev蛋白和DDX3的过表达载体,并初步证明人DDX3解旋酶可促进HCV RNA的复制,而Rev蛋白和DDX3共同作用可抑制HCV RNA的复制。

DEAD-box RNA解旋酶5和转录因子12与肌萎缩侧索硬化症的关系

目的通过检测DEAD-box RNA解旋酶5(DDX5)和转录因子12(TCF12)在SOD1-G93A突变型肌萎缩侧索硬化症(ALS)转基因小鼠海马中表达情况及其相互作用关系,揭示DDX5和TCF12表达改变与ALS海马病变的关系。方法将42对SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠和野生型小鼠,按照95 d龄(发病早期)、108 d龄(发病中期)和122 d龄(发病晚期)分为3组,通过RT-PCR、Western blotting和免疫荧光双标记技术,检测DDX5和TCF12在海马中的表达情况,通过免疫共沉淀技术检测DDX5和TCF12蛋白之间是否具有相互作用。结果与同龄野生型小鼠相比,在SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马中DDX5和TCF12 m RNA无明显变化,而蛋白在95 d、108 d和122 d表达均上调,差异均有统计学意义。海马齿状回和海马本部均可见DDX5和TCF12阳性细胞,且DDX5和TCF12在海马神经元中表达。SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马中DDX5和TCF12免疫阳性反应均较同龄野生型小鼠增强。免疫共沉淀实验检测发现,DDX5和TCF12蛋白质之间存在相互作用。结论DDX5和TCF12蛋白在SOD1-G93A突变型ALS转基因小鼠海马组织中表达上调,DDX5和TCF12表达异常与ALS海马组织病变有关。

以寨卡病毒NS3解旋酶为靶点的海洋天然产物库的虚拟筛选与成药性评价

寨卡病毒病自2015年在巴西等南美洲国家爆发后,已成为影响全球公共卫生的重大问题,但至今仍无可用于治疗该病的获批特效药.运用基于结构的药物虚拟筛选技术,以寨卡病毒NS3解旋酶的2个最新报道的结合位点为口袋,通过海洋天然产物库进行分子对接,初步得到divanchrobactin、bromophenol、2-hydroxy-1′-methylzeatin、garveatin E、aromatic polyketides、dimeric terrestrols等10个化合物,它们能很好地靶向寨卡病毒NS3解旋酶,从而可能成为对寨卡病毒病具有潜在治疗作用的海洋天然产物.同时,利用薛定谔软件套装中的ADMET预测模块对结合较好的化合物展开初步的成药性评价,发现除Divanchrobactin有较严重的成药性问题外,其他化合物均满足药物开发的基本要求,这为后期的实验研究提供了理论基础.

HCV NS3解旋酶结构及其解旋机制研究进展

NS3是由HCV编码的大约3000aa长度的多聚蛋白的1027～1659位aa组成。有丝氨酸蛋白酶。NTP酶及解旋酶活性。其中NS3解旋酶与病毒的复制密切相关。本文就近年来HCVNS3解旋酶做一综述。

低温诱导型凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶基因的克隆与表达分析

为研究凡纳滨对虾耐寒性状的分子基础,克隆鉴定了凡纳滨对虾DEAD-box RNA解旋酶的同源基因。根据差减文库中筛选到的一个低温上调表达的DEAD-box RNA解旋酶基因片段,通过RACE PCR扩增获得两条高度相似的c DNA全长序列,两条c DNA均为1430 bp,包含139 bp 5′UTR、79 bp 3′UTR和1212 bp开放阅读框,编码403个氨基酸残基。Blast比对结果显示,两条c DNA与其他物种的DDX5相似性最高,推测为凡纳滨对虾DDX5基因的两个变异体,分别命名为Lv DDX5variant A(Lv DDX5A)和Lv DDX5variant B(Lv DDX5B),在系统进化树中,Lv DDX5A和Lv DDX5B聚为最近的一支,并与虾类DDX5、文昌鱼DDX、贝类的DDX5距离较近。Real-time PCR分析结果显示,Lv DDX5A和Lv DDX5B都呈多组织遍在表达,在精巢、鳃、肠、肌肉和卵巢中,Lv DDX5B表达量高于Lv DDX5A,而在肝胰腺中Lv DDX5A表达量高于Lv DDX5B。在低温胁迫对虾肝胰腺和心中,Lv DDX5A呈上调表达而Lv DDX5B表达量无明显变化。进一步对Lv DDX5A在不同低温条件胁迫对虾的肝胰腺中表达变化进行了分析。结果显示,Lv DDX5A在18℃、15℃、13℃和11℃低温胁迫36h均被诱导表达,并随着15℃和13℃低温胁迫时间的增加呈先上升后下降的表达模式,在48h达到峰值,Lv DDX5A的低温诱导表达模式暗示其可能是在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用的剪接体。

低温胁迫下红榄李(Lumnitzera littorea)DEAD-box RNA解旋酶基因的表达分析

转录组分析发现DEAD-box RNA解旋酶家族参与红榄李(Lumnitzera littorea)对低温胁迫的响应。本文对4个低温显著差异表达基因LlDEAD12,LlDEAD32,LlDEAD43和LlDEAD65的生物信息学特性、组织特异性以及在不同温度处理下的红榄李幼苗中的差异表达进行研究。结果表明,LlDEAD12、LlDEAD32、LlDEAD43和LlDEAD65均属于疏水性蛋白,二级结构均由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,具有多个糖基化位点和磷酸化位点,且不含有跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位分析表明,LlDEAD12和LlDEAD32分别定位于细胞质和细胞核,而LlDEAD43和LlDEAD65则定位于线粒体上。通过蛋白质氨基酸序列的比对分析发现LlDEAD12、LlDEAD32和LlDEAD43分别与马尾松(Pinus massoniana)、巨桉(Eucalyptus grandis)和石榴(Punica granatum)的DEAD-box RNA解旋酶有较近的亲缘关系。荧光定量PCR技术分析发现,LlDEAD12和LlDEAD32在叶中高表达,LlDEAD43和LlDEAD65在茎和花中高表达,但这4个基因在根中都不表达,说明这4个基因对红榄李生长发育的调控主要集中在叶、茎和花等器官。低温胁迫对红榄李幼苗这4个基因的表达均有显著的抑制,说明它们参与了红榄李在低温环境下的分子响应,其中LlDEAD12和LlDEAD32可能参与了叶绿体的发育, LlDEAD43和LlDEAD65可能参与到了维持线粒体功能的稳定。以上结果可为红榄李抗冷性苗木的培育提供科学依据。

DDX3 RNA解旋酶在基因调控、肿瘤和病毒感染中的功能

DEAD-box RNA解旋酶DDX3是一种多功能的蛋白,其参与RNA代谢的多个过程,包括转录、剪接、mRNA核输出、翻译、RNA降解和核糖体生物合成。此外,DDX3还参与了细胞周期调控、细胞凋亡、Wnt-β-catenin信号和肿瘤发生等。最近研究表明,DDX3参与天然免疫信号通路并且促进抗病毒分子(如:干扰素调控因子3和Ⅰ型干扰素)的产生,DDX3也是一些病毒的主要靶点,因此,DDX3可作为研发抗病毒药物的新靶点。本文简单介绍了DDX3的结构和功能,总结了其在基因表达调控、细胞周期调控和细胞凋亡过程中发挥的作用,最后阐述了病毒如何通过与DDX3的互作调控宿主先天性免疫,以期为细胞的稳态调控和抗病毒先天性免疫调控提供新的思路。

DEAD-box RNA解旋酶41在髓系肿瘤中的作用机制的研究进展——骨髓增生异常综合征/急性髓系淋巴细胞白血病

DEAD-box RNA解旋酶(DEAD-box helicase,DDX)参与RNA代谢的各个过程,包括基因转录、前体RNA剪切、mRNA转运和翻译、核糖体合成以及miRNA的调控等。DDX家族成员的突变对RNA代谢的影响可导致一系列疾病的产生。DEAD-box RNA解旋酶41(DDX41)是DDX家族的一个重要成员,该分子是剪切复合体的一个重要组成成分,其突变可导致个体出现骨髓增生异常综合征,进而导致急性髓系淋巴细胞白血病这一血液恶性肿瘤的出现,严重影响患者的生存和预后。本文就DDX41在上述血液恶性肿瘤中的作用机制的研究进展作一综述。

猪圆环病毒3型Rep蛋白的原核表达及酶活性分析

Rep蛋白对猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)的复制具有重要作用。为分析PCV3 Rep蛋白的核酸内切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性,作者使用镍亲和层析法纯化相应的重组蛋白,通过优化反应条件,建立Rep蛋白酶活性的测定方法,并探究Rep蛋白关键活性位点。结果表明,Rep蛋白在体外具有核酸内切酶活性、ATPase活性和解旋酶活性。当蛋白浓度为1.6μmol·L^(-1),Mg^(2+)浓度为1.0 mmol·L^(-1),37℃反应75 min时其ATPase活性达到最佳。当蛋白浓度为7μmol·L^(-1),Mg^(2+)浓度为12.5 mmol·L^(-1),37℃反应60 min时其解旋酶活性达到最佳。Y89为Rep蛋白核酸内切酶活性的关键位点,K173、D210、N250为ATPase活性和解旋酶活性的关键位点。本研究建立了PCV3 Rep蛋白酶活性分析的方法,初步揭示了该蛋白的主要功能位点,为Rep蛋白的功能研究以及基于Rep蛋白活性的抗病毒药物研究奠定了基础。

DDX3X/NF-κB通路介导蛛网膜下腔出血小鼠早期神经元凋亡

目的:研究DDX3X/NF-κB通路在蛛网膜下腔出血(SAH)小鼠早期神经元凋亡过程中的作用。方法:利用颈内动脉穿刺的方法构建SAH小鼠模型,对小鼠进行神经功能评分。使用表达DDX3X靶向shRNA的重组慢病毒(Lv-shDDX3X)预先敲低脑内DDX3X的表达,或者通过NF-κB抑制剂NF-κB-IN-1(简称IN-1)抑制NF-κB信号通路,利用Western Blot检测小鼠皮质DDX3X和NF-κB(p65)的表达,通过TUNEL/NeuN染色检测各组小鼠大脑皮质神经元的凋亡。结果:SAH术后24 d小鼠神经功能显著障碍(P<0.05),皮质中DDX3X表达显著增加而NF-κB(p65)的表达显著降低(P<0.05)。预先敲低DDX3X后,小鼠神经功能显著恢复,NF-κB(p65)蛋白表达显著高于SAH组(P<0.05);当在敲低DDX3X表达的同时使用IN-1抑制NF-κB活性,则小鼠神经功能恢复不明显。TUNEL/NeuN染色显示敲低DDX3X表达后小鼠脑组织中TUNEL阳性的死亡神经元数量少于SAH组(P<0.05),而如果在敲低DDX3X表达的同时使用IN-1抑制NF-κB活性,则TUNEL阳性的神经元数量减少不明显。结论:DDX3X/NF-κB通路介导了SAH后早期脑损伤小鼠的细胞死亡。

黄鳝DEAD-box家族PL10基因的克隆与序列分析

通过PCR克隆的方法,从黄鳝(Monopterus albus)中得到两个PL10 基因的cDNA片段Mo PL10A和Mo PL10B,长度均为1.127 kb,推测其编码375个氨基酸的蛋白片段.结合其他PL10类同源物序列,对这两条cDNA进行了分析和初步的功能推测.根据此片段的氨基酸序列构建的系统发育树与形态分类结果一致.在不同组织中的RT PCR结果表明Mo PL10A和Mo PL10B的mRNA在各组织中的分布有差异.

DEAD-box基因家族在拟南芥生长发育中的作用

在RNA代谢过程中,需要许多蛋白和核酸的参与,其中一类蛋白就是RNA解旋酶。RNA解旋酶通过水解ATP获得能量来参与RNA代谢的多个方面,包括核内转录、pre-mRNA的剪切、核糖体发生、核质运输、蛋白质翻译、RNA降解、细胞器内基因的表达。DEAD-box蛋白家族是RNA解旋酶中最大的亚家族,它具有9个保守结构域,因motifyⅡ的保守氨基酸序列Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)而命名。该家族在酵母、拟南芥(Arabidopsis thaliana Heynh.)和人类基因组中都有较多的家庭成员。近年来,研究者对拟南芥DEAD-box蛋白家族的结构和功能进行了一些研究,本文着重总结DEAD-box基因家族对拟南芥生长发育的影响。