MicroRNA-155对3种可经输血传播RNA病毒复制的影响及机制探究

目的 了解经血传播的RNA病毒感染细胞后对小分子非编码RNA-155 (miR-155)的诱导作用及miR-155对这类病毒复制的影响。方法 在2×10~5/mL肝癌细胞系Huh7.5.1中分别感染3种RNA病毒HCV、DENV和ZIKV,感染复数(MOI)为0.2,感染后48 h,提取胞内RNA,通过荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法,检测病毒感染后miR-155的相对表达变化;同时在2×10~5/mL Huh7.5.1细胞中转染10 pmol的miR-155模拟物(miR-155 mimic)使miR-155高表达,转染后12 h分别接种0.2 MOI的3种病毒,感染后48 h提取胞内RNA,通过荧光定量PCR检测3种病毒RNA的复制水平及宿主抗病毒先天免疫相关基因表达水平。结果 与未感染病毒的Huh7.5.1细胞相比,HCV、DENV及ZIKV感染Huh7.5.1细胞48 h后,miR-155的相对表达分别升高了132倍、157倍和8倍。与转染阴性对照组相比,miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,HCV、ZIKV和DENV的复制分别降低了48%、54%和70%;miR-155高表达的Huh7.5.1细胞中,IFNβ及一些干扰素刺激基因的表达明显升高。结论 HCV、DENV和ZIKV感染Huh7.5.1细胞后,显著诱导细胞中miR-155的表达;miR-155在细胞中高表达后,通过调节宿主细胞中Ⅰ型干扰素及一些干扰素刺激基因的表达来抑制HCV、DENV和ZIKV的复制。

新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究

目的 筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法 大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧光定量PCR法检测化合物对病毒RNA合成的影响;免疫荧光法检测病毒复制中间体dsRNA以及病毒蛋白合成;蛋白免疫印迹法检测化合物对病毒蛋白合成量的影响;时间点处理实验判断抗病毒作用阶段。结果 2,5-二氢-1,2-二苯基-4-环己氨基-5-氧代-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(Z1)与NS5 RdRp具有结合活性,在细胞水平上具有抗DENV2活性,半数有效浓度(EC50)为4.75μmol·L-1。Z1抑制DENV2 RNA合成,抑制病毒dsRNA的合成,并抑制病毒蛋白的合成,其抑制作用发生在病毒进入后阶段。结论 Z1是新型的登革病毒NS5 RdRp抑制剂,其明显抑制登革病毒RNA的合成,并进一步抑制病毒蛋白的翻译合成,从而抑制子代病毒的复制和释放,其可作为新型的抗登革病毒先导化合物用于进一步的开发。

Ⅲ型登革病毒感染THP-1细胞及其介导的抗体依赖性增强感染中差异性LncRNA的CeRNA网络构建

目的在急性单核细胞白血病细胞(THP-1)水平建立Ⅲ型登革病毒(Dengue virus typeⅢ,DENV-3,DV-3)感染和抗体依赖性增强(antibody dependent enhancement,ADE)感染模型,探讨胞内长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)的差异性表达,绘制竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA,CeRNA)调控网络并进行LncRNA翻译功能预测。方法DENV-3感染C6/36细胞6 d后,收获培养上清,采用CCID50法测定病毒滴度,并通过PCR进行型别以及基因组全长扩增鉴定;扩增DENV-3标准质粒,PCR鉴定,绘制标准曲线;将THP-1细胞分为阴性对照(THP-1)、直接感染(DV-3)、ADE及空白对照[1640(-)]组,感染48 h后提取胞内总RNA,测定病毒拷贝数;通过全转录组测序技术,对THP-1 vs DENV-3、THP-1 vs ADE、DENV-3 vs ADE各组中上调和下调前5个的LncRNA进行CeRNA调控网络构建,并分析其编码蛋白的功能。结果DENV-3感染C6/36细胞3 d后有明显的细胞融合、空泡和脱落;病毒滴度约为1.0×10^(4.64)PFU/mL,PCR特异引物鉴定为DENV-3,获得病毒完整的基因序列;ADE组胞内病毒核酸拷贝数明显高于DV-3组和空白对照组;在THP-1 vs DENV-3中,预测到人细胞黏附蛋白相互作用蛋白(cytohesin interacting protein,CYTIP)的表达量出现上调;在THP-1 vs ADE中,预测到驱动蛋白家族成员5A(kinesin family 5A,KIF5A)的表达量下调;在DENV-3 vs ADE中,预测到簇分化抗原9(cluster differentiation antigen 9,CD9)和胰岛素样生长因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)的表达量上调。这些差异性的LncRNA均具有开放阅读框(open reading frame,ORF),除了Lnc-SH3BP1和Lnc-RPL41以外,其余的LncRNA均具有内部核糖体结合位点(internal ribosome binding site,IRES)。结论在DENV-3感染THP-1细胞及其介导的ADE感染中,LncRNA的表达发生了明显的差异性改变,且可能通过多种生物学功能调控感染的进程,有助于更深层次理解ADE感染的发生机制。

登革热患者尿液中病毒核酸检测及其临床意义

目的检测登革热患者尿液中登革病毒核酸(DENV-RNA),探讨其实验室诊断价值并进行相关影响因素分析。方法对广州市第八人民医院在2013年8-11月收治的57例登革热住院患者,收集病程早、中、晚期的73份血浆和156份尿液标本,通过实时RT-PCR方法检测DENV-RNA。结果血浆中DENV-RNA检出率高于尿液(96.1%vs.70.2%,P=0.000)。血浆中DENV-RNA的检出率在病程早期、中期和晚期,分别为100.0%、81.8%和40.0%。尿液中DENV-RNA的检出率在病程早期、中期和晚期,分别为59.3%、61.8%和50.0%,以病程中期检出率较高。2例患者血浆核酸阴性而尿液阳性。6例无血浆标本的患者,尿液中可检出DENV-RNA。对照组20份尿液中DENV-RNA均未检出。相关影响因素分析显示,尿液中病毒核酸检出率与患者的疾病严重程度及合并急性肾损伤无关(P均>0.05)。结论用RT-PCR方法检测登革热患者尿液中病毒核酸,可作为实验室病原学诊断的补充手段。

登革病毒实验室诊断方法研究进展

目前登革病毒(dengue virus, DENV)已被世界卫生组织视为热带及亚热带地区的重大公共卫生问题。近年来全球范围内登革热疫情频发,有愈演愈烈的趋势。仅2019年已在菲律宾、泰国、孟加拉国、缅甸及中国重庆市暴发了不同程度的登革热疫情。DENV的实验室诊断方法对于登革疫情的防控意义重大。为此本文对现阶段DENV实验室诊断方法及策略进行综述。通过回顾以往传统性诊断方法,展望新兴的诊断策略,为登革疫情暴发时选择合适的实验室诊断方案提供参考。