DEV-NP基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测

为构建鸭肠炎病毒(DEV)核衣壳蛋白(NP)基因酵母双杂交诱饵载体,采用PCR技术扩增出DEV-NP基因,克隆至酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,以PCR检测、限制性酶切和序列测定等方法进行鉴定;然后采用PEG/LiAc法将阳性质粒pGBKT7-NP转化酵母Y2HGold,在不同营养缺失型培养基进行自激活检测,结果显示,经PCR检测和EcoR I/BamHⅠ双酶切,可见到与预期相一致的目的片段;测序表明该片段含DEV NP基因全部序列;转化Y2HGold酵母菌后,在SD/-Trp/X-α-Gal固体培养基上长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上未见有菌落生长。无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-NP的成功构建,为DEV NP宿主结合蛋白的筛选奠定了基础。

鸭源PKCI miRNA表达载体的构建及鉴定

为给蛋白激酶C抑制蛋白（PKCI）在鸭肠炎病毒增殖的作用机制奠定基础,根据PKCI基因mRNA序列及miRNA设计原则,合成4对miRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒进行重组质粒构建,插入miRNA表达载体（pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR）构建表达质粒,转化至感受态细胞DH5α,筛选并提取重组质粒进行测序分析。结果表明：在含壮观霉素的LB平板可生长出含目的基因的重组细菌菌落;测序表明成功构建了鸭源PKCI基因miRNA表达载体,重组质粒pSilencer-PKCI-1～pSilencer-PKCI-4的插入部分大小为71～134bp、68～131bp、68～130bp和68～131bp;重组质粒miRNA有鼠类miR-155骨架结构,即左侧为天然miR-155结构,右边为发卡结构的末端环区（internal loop）和配对区域内部的末端环区miRNA结构。