PLFA法和DGGE法分析堆肥细菌群落变化

同时采用PLFA(Phospholipid fatty acid)谱图分析法和DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)法分析农业废物堆肥化过程中细菌群落的变化。结果表明:(1)单体PLFA数据显示样品之间的群落结构有明显差异,随着堆肥进程的进行,群落在不断演替,PLFA数据可以较为明确地表征微生物生物量的变化,但不能给出具体的物种变化信息;(2)DGGE分析显示堆肥过程中的样点和DGGE条带数据都存在3大主要类别,堆肥过程中细菌群落结构至少经历了3个阶段的演替,即嗜温细菌群落、高温细菌群落和腐熟期细菌群落。堆肥过程是微生物群落结构与堆肥温度相互制约的过程;(3)虽然两类方法显示的信息并不完全一致,但也因此说明了不同方法显示的信息并不是绝对的,采用各类方法组合研究堆肥微生物的信息变化是很有必要的。

内蒙古典型草原细菌群落结构的PCR-DGGE检测

用液氮冻融法和蛋白珠法对内蒙古典型草原土壤基因组DNA进行提取,用PCR-DGGE对细菌群落结构进行分析,并对主要的条带进行测序。发现蛋白珠法比液氮冻融法更能反应出实际的微生物群落结构和组成。内蒙古典型草原土壤细菌主要有5个分支:放线菌门(Actinobacteria),变形菌门(Proteobacteria)的α、β及γ类群,拟杆纲门(Bacteriodetes),芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和酸杆菌门(Acidobacteria)。与基因库中进行比较后发现有4个序列和已知的细菌种类相似达到了99%以上。

冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-DGGE的影响

比较研究冷却猪肉不同前处理对细菌DNA提取及PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)的影响。冷却猪肉4℃贮藏至第5天时,分别采用冻融、超声、摇床和匀浆前处理后,提取细菌DNA,进行Dilution-PCR和DGGE分析。结果表明,不同前处理方法所制备的DNA量稍有差别,但对PCR-DGGE结果无显著影响,故可根据实际情况选择上述不同前处理方法。同时对16S rDNA V3区的DGGE图谱进行割胶测序,检测到腐败菌主要是假单胞菌属,其他还有不动杆菌属、环丝菌属和沙雷氏菌属。

PCR-DGGE技术用于石油污染土壤中微生物群落结构多样性的初步研究

采用现代分子生物学技术,结合传统的富集培养过程,直接从土壤中提取细菌总DNA和从培养基富集培养的菌体中提取总DNA,并对基因组总DNA中16S rDNA V3可变区进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定,对油田某区块石油污染土样微生物群落和多样性进行初步研究。结果表明,年代较久的石油重度污染土壤菌群数量少于轻度污染土壤,经人工堆肥处理的土壤生物多样性明显优于未进行人工处理的污染土壤;经堆肥处理的土壤中微生物多样性在纵向上也存在差异,中层土微生物多样性明显,表层土最不明显;不同污染土壤中存在一定数量相同的优势菌群,但也表现了相当的差异性,经堆肥处理的污染土壤中微生物群落组成的相似性在纵向上也存在差异。

DNA提取方法对苎麻脱胶菌群PCR-DGGE结果偏移的影响

为筛选和优化出较适宜的苎麻脱胶菌群DNA提取方法,本文分别以来自苎麻沤麻环境的6种纯培养菌等丰度混合物和苎麻自然沤麻菌群为材料,研究"溶菌酶-SDS"法、"超声波-溶菌酶-SDS"法、"蛋白酶K-SDS"法以及"冻融-蛋白酶K-SDS"法4种DNA提取方法对菌群16Sr DNA基因PCR-DGGE偏移结果的影响。结果表明,4种方法均能从2类材料中提取出了超过1600ng/μL的DNA,不同方法之间DNA产率略有差异,经过超声波处理或反复冻融处理的DNA有明显的降解,但4种方法提供的DNA模板均扩增出了450bp的16Sr DNA基因片段。4种DNA提取方法对DGGE结果有明显影响,且只有"冻融-蛋白酶K-SDS"法检测到了纯培养菌混合物中的全部6种细菌,4种方法获得的自然沤麻菌群的DGGE指纹图谱也明显不同,最多产生17条带("冻融-蛋白酶K-SDS"法),最少只有9条带("溶菌酶-SDS"法),增加超声波或冻融等物理处理可以使部分弱带变强。因此,组合应用物理、生物和化学等细胞裂解方法可以提供更有代表性的DNA,可减少PCR-DGGE结果的偏移。

PLFA法和DGGE法分析制曲过程微生物群落变化

同时采用PLFA(Phospholipid fatty acid)谱图分析法和DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)法分析大曲制曲过程中微生物群落的变化。结果表明:真菌类微生物生物量呈现先下降后上升趋势,发酵第7天各种微生物含量达到极限值,随后呈下降的趋势。通过贮存期间的不断筛选和驯化,逐渐形成了大曲制作过程中稳定的微生物群落结构。通过DGGE对大曲制曲过程的微生物群落结构分析,细菌共检测到20条带,包括魏斯氏菌属、芽孢杆菌属、乳酸菌属、杆菌属、球菌属,其中芽孢杆菌所占的比例最高,其次为乳酸菌属。在制曲过程中的真菌优势谱带在各个培养阶段是基本相同的,仅初始阶段强度相对较弱的谱带在后期消失了。虽然显示的信息两种方法并不完全吻合,但也说明了不同方法表征的信息并不是绝对的,采用两种方法组合研究大曲微生物的信息变化是很有必要的。

PCR-DGGE蝴性结肠炎大鼠胃肠道中细菌多样性研究

目的探讨溃疡性结肠炎对大鼠胃肠道微生物多样性影响，为治疗溃疡性结肠炎提供可靠依据。方法采用2，4-二硝基氯苯乙酸复合法对健康SD大鼠进行溃疡性结肠炎造模；运用CTAB—SDS法提取肠道微生物总DNA，通过PCR．DGGE分析溃疡性结肠炎大鼠之间胃肠道微生物多样性差异。结果溃疡组、用药组和正常组大鼠的消化道中，不同部位细菌Shannon~数变化较大（1．64-3．05），结肠中Shannon指数最高，其次是胃，小肠最低。在结肠，不同组的细菌多样性Shannon指数变化幅度不大，以用药组最高（3．05），其次溃疡组（2．98），正常组2．95，说明大鼠结肠在健康状态下细菌多样性最低，结肠炎后会发生一定的变化。此外，发现病变后的大鼠胃中拟杆菌属、梭菌属、普氏菌属、紫单胞菌属等厌氧细菌增加，病变后的结肠中乳杆菌属细菌明显减少，紫单胞菌属和梭菌属细菌明显增加；病变后小肠中部分乳杆菌种类消失，同时梭菌属和紫单胞菌属等不常见菌群的出现。结论溃疡性结肠炎大鼠胃、小肠、结肠中有益菌乳杆菌明显减少，普氏菌属、紫单胞菌属、梭菌属等明显增多，这些菌属可作为条件致病菌引起内源性感染，可能是造成溃疡性结肠炎的重要原因。

Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (PCR-DGGE) Profile of Bacterial Community from Agricultural Soils in Bauchi, North-East Nigeria

The population dynamics of bacterial community was investigated in three Agricultural soils, designated as Loamy sand (A), Peaty coarse (B) and Loamy coarse sand (C) in North-East, Nigeria. The soil chemical properties were characterized to fully understand their nature. Metagenomic approach was used to extract soil DNA using the fast DNA Spin Kit extraction technique. The PCR-electrophoresed DNA bands were excised and subjected to a full scale Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) analysis. DGGE fingerprinting for the PCR-16S rDNA product revealed a diverse profile of complex population of bacterial community in the study area. The study shows that more bacterial community can be fully investigated using molecular techniques rather than traditional culture method. The implication of the results obtained is discussed.

不同碳源富集的石油烃降解菌群结构的分析

以原油和正十六烷为唯一碳源,从长期受石油污染的环境中富集和分离具有不同功能的石油烃降解菌,并利用平板法和PCR-DGGE法对不同碳源富集到的菌群结构进行分析。结果表明,利用2216E平板从以原油和正十六烷为碳源的富集液中各得到两株菌,分别为TJ-1、TJ-2和TJL-1和TJL-2,分子生物学方法鉴定结果表明,这4株菌分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、Oceanobacillus picturae和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。PCR-DGGE分析结果表明,以原油和正十六烷为碳源的富集液中优势菌分别有5种和2种,且2种富集液中的优势菌明显不同。对比PCR-DGGE和平板法分析结果,可以看出PCR-DGGE法能够提供更全面的菌群结构信息。

厌氧除磷菌的富集及功能菌组成研究

[目的]富集厌氧除磷菌,并对功能菌的组成进行研究。[方法]利用厌氧连续流反应器,以养殖场新鲜鸡粪为种泥,控制和保持反应器内ORP为-337～-230 mV,pH 6～7,温度30～35℃,富集厌氧除磷功能菌。跟踪监测反应器进出水的总磷(TP)、磷酸盐(PO43--P)和氨氮(NH2-N)去除率。当TP的去除率达到60.89%时,取样进行PCR-DGGE分析,用MEGA 4.0软件构建系统进化树。[结果]鸡粪在反应器中连续培养140 d后,TP的去除率平均达到39.86%,大大高于文献报道的24.19%,PO43--P去除率平均达到40.82%,NH3-N的去除率平均达到34.39%;NH3-N与TP的去除率之间存在一定的相关性,厌氧条件下可达到同时脱氮(去除氨氮)除磷(还原磷酸生成磷化氢)的效果;通过对样品的PCR-DGGE分析和进化树分析,获得一种具发酵功能的乳球菌属(Lactoccus)和一种具有发酵、固氮和厌氧除磷功能的梭菌属(Clostridium)。[结论]该研究可为厌氧除磷机理提供理论依据。

转基因水稻对土壤微生物群落结构及功能的影响

以非转基因水稻为对照,以变性梯度凝胶电泳(DGGE)和Biolog技术为手段,研究了2种转基因水稻对土壤微生物群落结构及功能的影响。结果显示:转基因水稻仅在生长发育旺盛期对土壤细菌数量有显著影响;且不同品种转基因水稻土壤微生物间的遗传距离大于转基因水稻与对照间土壤微生物的距离,即2个转基因水稻品种对土壤微生物群落遗传多样性的影响均不显著;在水稻抽穗期,2种转基因水稻与其对照的土壤微生物群落在72h时的平均光密度呈现显著差异,而到了成熟期则差异不显著。土壤微生物群落多样性指数和均匀度指数也表现出类似趋势。本试验证明,在水稻生长发育旺盛时期,Mclntosh指数(u)是一个有效区分转基因水稻和非转基因水稻土壤微生物群落多样性的指标。

分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用

应用PCR—DGGE技术对某微生物肥料的质量进行了跟踪监测，并结合分离培养和克隆文库分析对其菌种组成进行了检测。结果表明，同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌DGGE（denaturing gradient gel eleetrophoresis）图谱相似性为80％-100％，3个不同生产批次之间DGGE图谱相似性为80％-88％，表明该微生物肥料的菌种组成的稳定性较好。但分离培养和克隆文库分析结果显示样品的菌种组成与产品标签说明之间存在较大差异。对于产品标注的6种微生物组成，只有Lactobacillus属的微生物可与之对应，其他检测到的Bacillus、Monascus、Brevibacillus、Psudomonas和Penicillium属的微生物并未包括在产品说明中。研究表明用分子生态学方法可以比较客观准确的对微生物肥料质量进行评估和峪测。

高温环境样品总DNA直接和间接提取方法的比较

分别采用两种环境总DNA直接提取法和一种间接提取法从6种温泉菌席样品中提取总DNA,以DNA粗产物的纯度、能否用于后续PCR扩增及PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)所反映的微生物多样性为评价指标对两类方法进行比较和评价。研究发现,虽然间接提取法效率低下,但对于高温极端环境中生物量较小的样品,间接法能得到有研究价值的、纯度较高的环境样品总DNA,而直接法得到的DNA量小且不适于PCR扩增操作。在使用这2类方法都能得到可用于研究操作的DNA的情况下,间接提取法能更好的体现环境样品中微生物的多样性。

抗草甘膦转基因大豆对根际土壤细菌多样性的影响

采用DGGE-cloning测序技术研究抗草甘膦转基因大豆在生长期内对根际土壤细菌多样性的影响。结果分析表明,不同生长期内抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆根际土壤细菌16S rDNADGGE指纹图谱谱形相似,仅在出苗期和鼓粒期出现两条差异带,分别属于芽单胞菌门(UnculturedGemmatimonadetes bacterium clone,缺失)和壁厚菌门(Uncultured Firmicutes bacterium cloneGASP-KC3W1_H04,增加);不同生长期内抗草甘膦转基因大豆与非转基因大豆根际土壤细菌16SrDNA DGGE指纹图谱的多样性指数和均匀度指数无显著差异。因此,抗草甘膦转基因大豆对土壤细菌多样性无显著影响。

清香型小曲白酒中微生物组成及功能微生物的分析

将PCR-DGGE技术和传统微生物培养方法相结合,分析清香型小曲白酒的微生物群落结构及功能微生物。小曲和酒醅中优势微生物种属基本一致。不同季节酒醅中微生物组成无明显变化,但微生物生长和消亡规律存在差异。小曲酒中细菌的种类较多,主要以乳酸菌和芽孢杆菌属为主,但对小曲白酒风味特征影响很小。酵母类主要包括Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala、Issatchenkia orientalis和Saccharomyces cerevisiae。S.cerevisiae的作用是酒精发酵产生乙醇,Sp.fibuligera、P.anomala和I.orientalis是产酯酵母,增加酒体酯香味。霉菌种类相对较少,Rhizopus oryzae是主要糖化菌。

变性梯度凝胶电泳在环境微生物研究中的应用详解

结合笔者等多年积累的经验详细介绍环境微生物学研究中变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术应用全步骤:从环境样品中直接提取总DNA,利用5′端含GC夹子的引物PCR 16S rDNA的部分片段,将PCR产物在含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析,使不同来源的DNA片段在电泳胶中分离,从胶中切出分离的DNA片段测定碱基序列,进行分类分析。PCR-DGGE技术能够检测不可培养的微生物基因,而DGGE技术与克隆等其他技术结合更能发挥其分离作用。

不同年龄麦洼牦牛肠道菌群的分离鉴定及其群落结构的变化

为了解麦洼牦牛肠道细菌群落结构组成和功能及其动态变化过程,同时获得具有潜在益生菌活性和应用可能性的肠道菌株,采用不同的培养基在不同的培养条件下分离麦洼牦牛肠道细菌并进行16S r DNA分子鉴定,同时采用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术分析不同年龄麦洼牦牛肠道细菌的群落结构和功能及其差异。结果表明,从不同年龄麦洼牦牛大肠内容物中共分离到90株细菌,其中3株归为放线菌门(Actinobacteria),64株为厚壁菌门(Firmicutes),23株为变形菌门(Proteobacteria);分离到的34株芽孢杆菌属(Bacillus)和14株乳酸杆菌属(Lactobacillus)细菌具有潜在益生菌活性,可作为微生物饲料添加剂补饲麦洼牦牛;对DGGE图谱的UPGMA聚类、PCA和多样性指数分析显示,不同年龄的麦洼牦牛肠道细菌的群落结构有差异,相同年龄的个体相似度较高,而不同年龄的个体相似度较小,较大年龄(2.5和3.5岁)的牦牛肠道菌群多样性大于较小年龄个体(0.5和1.5岁),且分布更均匀,肠道菌群随宿主年龄变化是一个动态变化并趋于稳定的过程;DGGE条带的物种鉴定结果表明,大部分条带为未(能)培养细菌,PCR-DGGE与分离培养法结合可以很好地表征麦洼牦牛肠道菌群的结构和功能。

施肥对大棚黄瓜根际微生物群落结构和数量消长的影响

采用传统分离计数法分析了单施有机肥、单施复合肥、复合肥+有机肥混合施用条件下设施黄瓜根际真菌、细菌、放线菌、亚硝酸细菌、硝化细菌、反硝化细菌的消长,同时采用基于rDNA特异性扩增的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析了黄瓜根际细菌遗传多样性和均匀度。结果表明,单施有机肥最有利于根际真菌和放线菌的生长繁殖,对于根际亚硝酸细菌、硝化细菌的生长繁殖也具有一定的促进作用,根际细菌多样性指数和均匀度指数均较高。施用有机肥是一种比较理想的施肥方式。

堆肥中微生物总DNA的高效提取

采用化学裂解和酶解相结合的方法,选择加入PVPP的高盐缓冲液作为细胞裂解的反应体系,并以PEG-8000进行DNA沉淀,从高有机含量的堆肥样品中进行微生物总DNA的提取。结果表明,从4种性质不同的堆肥中均获得了高质量的微生物总DNA,所得的DNA分子片段在23kb左右;每克干重堆肥的总DNA提取量为63.54±12.08μg^106.50±28.36μg,A260/A280大于1.6,A260/A230大于1.8,不用经过纯化可以直接进行PCR扩增和限制性酶切;以该DNA为模板进行微生物区系的DGGE分析,显示了丰富的微生物多样性。该方法减少了通常环境样品DNA提取过程中的纯化步骤,减少了DNA的损失,为从事微生物分子生态学,尤其是那些针对高有机含量以及获取极为不易的环境样品的研究而言是十分有益的。

排除法PCR加变性梯度凝胶电泳鉴别未知基因

通过鉴别未知的cry4亚组基因来确定排除法PCR加变性梯度凝胶电泳新方法。方法 :应用排除法PCR的组基因和亚组基因引物扩增杀蚊毒素基因 ,cry4。这些引物是根据已知的cyr4基因的共有或特有DNA片段来设计的。组基因引物扩增产物被用于变性梯度凝胶电泳。平行变性梯度凝胶是由 8%的聚丙烯酰胺加上 2 0 %到 80 %的变性剂组成。结果 :已知的和未知的cry4亚组基因被组基因引物扩增的产物在变性梯度凝胶电泳被分离开。尽管它们之间仅有两个碱基对不同 (T在位置 2 2 4和G在位置 394)。应用组基因和亚组基因引物扩增 ,新发现的基因可被分类到次亚组基因水平。从 5个苏云金芽孢杆菌亚菌中发现三个未发表的cry4亚组基因。结论 :排除法PCR加变性梯度凝胶电泳是一个高度敏感、特异性和可靠性强的新方法 ,可用于鉴别各种未知的亚组基因。