基于DGKα-PA信号轴探讨扶正祛邪方对人肺癌H292细胞增殖、迁移的影响

目的探讨扶正祛邪方调节DGKα-PA信号轴对人肺癌H292细胞增殖、迁移的影响及可能机制。方法将H292细胞分为对照组和扶正祛邪方低、中、高浓度组,扶正祛邪方低、中、高浓度组分别予3、6、12 mg/mL扶正祛邪方干预48 h,对照组予等体积培养基常规培养。克隆形成实验观察H292细胞增殖情况,细胞划痕实验、Transwell实验观察细胞迁移和侵袭情况,ELISA检测细胞磷脂酸(PA)含量,Western blot检测细胞二酰甘油激酶α(DGKα)、蛋白激酶B(AKT)、p-AKT和雷帕霉素机械靶蛋白(mTOR)表达。结果与对照组比较,扶正祛邪方低、中、高浓度组细胞克隆形成数明显减少(P<0.05,P<0.01),细胞迁移率明显降低(P<0.01),侵袭细胞数明显减少(P<0.05,P<0.01),细胞PA含量明显减少(P<0.01),DGKα、p-AKT、mTOR蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),且以扶正祛邪方高浓度组抑制作用最明显(P<0.01)。结论扶正祛邪方可能通过DGKα-PA信号轴抑制人肺癌H292细胞增殖、迁移,其机制与抑制下游AKT/mTOR信号通路有关。

变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk突变的检测及临床意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株中耐酸相关基因dgk是否发生突变并推测该基因对变形链球菌耐氟菌株的影响。方法:体外人工诱导变形链球菌耐氟菌株,根据GenBank发表的变形链球菌dgk基因序列设计引物,对其耐氟菌株基因组进行PCR扩增,对扩增产物用DNA回收试剂盒回收鉴定,对回收产物用PGEM-T载体进行T-A克隆,构建重组质粒并测序。结果:PCR扩增获得与预期结果一致的特异性片段并发现8个碱基发生突变,突变位点分别在904(ATA→ATT)、940(GTG→GTC)、946(GAT→GAC)、952(GCC→GCT)、958(GAC→GAT)、964(CAT→CAC)、976(TTG→TTA)、991(AAG→AAA)。提交该序列到GenBank,获得登陆序列号为DQ272517。结论:变形链球菌耐氟菌株耐酸相关基因dgk发生点突变并属于同义突变。

DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体制备及感染结肠癌RKO细胞的干扰效应

目的应用RNA干扰技术构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,感染结肠癌RKO细胞,观察其抑制DGKζ表达的效率。方法运用Real-time PCR及Western blot检测8株结肠癌细胞中DGKζ基因的表达。针对DGKζ基因序列,设计RNA干扰靶点序列,合成含干扰序列的双链DNA oligo,慢病毒载体酶切,转染备好的细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的DGKζ基因RNA干扰慢病毒载体。慢病毒感染RKO细胞后,运用Real time PCR和Western blot法检测DGKζ基因的敲减效率。结果 8株结肠癌细胞株中,DGKζ在RKO细胞中的表达丰度最高,满足敲减要求;测序表明重组质粒构建成功;Real-time PCR实验结果显示,在RKO细胞中,相对于感染慢病毒空载体细胞,DGKζ基因的敲减效率均达到70%以上(P<0.05)。Western blot结果显示,RKO细胞和感染慢病毒空载体细胞(Negative control)在124k Da处出现免疫印迹,而干扰敲减DGKζ基因的细胞(sh RNA-DGKζ)则不表达内源性DGKζ蛋白,表明DGKζ基因慢病毒感染有很高的敲减效率。结论成功构建DGKζ基因敲减慢病毒载体,进一步证实了感染结肠癌RKO细胞的特异性干扰效应。

利用同源重组构建大鼠甘油二酯激酶γ(DGKγ)慢病毒过表达载体

背景:慢病毒载体作为外源性转基因载体已被广泛应用,但是大鼠甘油二酯激酶γ(diacylglycerol kinaseγ,DGKγ)基因慢病毒载体未见报道。目的:用同源重组的方法构建大鼠DGKγ慢病毒过表达载体。方法:提取成年SD大鼠脑组织总RNA,以反转录得到的cDNA作为模板,通过PCR反应分段扩增大鼠DGKγ基因CDS区5'端1 029 bp和3'端1 362 bp,用同源重组技术将这2个片段与线性化载体进行定向连接,构建CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体并进行PCR扩增及测序鉴定。经293T细胞包装后产生慢病毒,收集慢病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达并应用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测细胞中DGKγmRNA和蛋白的表达。结果与结论:CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒载体经PCR扩增和测序鉴定构建成功;经CMV-rat DGKγ-GFP慢病毒感染后的293T细胞,荧光显微镜下呈GFP阳性,实时荧光定量PCR显示DGKγmRNA的表达较空载体组显著升高(P<0.01),Western blotting显示DGKγ蛋白表达较空载体组极显著升高(P<0.001)。提示:成功构建了大鼠DGKγ慢病毒过表达载体,DGKγ在293T细胞有效高表达。

DGK在Hedgehog信号通路中的作用

目的 :研究甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase,DGK)对Hedgehog信号通路的调控机制。方法:蛋白质免疫共沉淀实验分析DGK蛋白与IFT88的结合情况;si RNA敲低DGK后,检测Hedgehog信号通路靶基因Gli1蛋白及m RNA的表达水平;激光共聚焦显微镜分析DGK缺失对原纤毛生长和IFT88蛋白在原纤毛内定位的影响。结果:DGK家族的7个成员都可以和IFT88发生特异性结合;si RNA敲低DGK后,通路靶基因Gli1的转录水平明显下降;DGK蛋白对于通路的调控部位介于Ptch1和Smo之间;DGKδ的缺失会抑制原纤毛的生长以及IFT88在原纤毛中的分布。结论:DGK的敲低影响了IFT88向原纤毛的运输,从而影响了原纤毛的结构和纤毛内转运的正常进行,DGK影响Hedgehog信号通路的正常转导及其活性,可能与其抑制原纤毛的生长有关。

E8.5-E12.5大鼠胚胎整体原位杂交技术

目的:通过优化实验条件,建立大鼠胚胎整体原位杂交方法。方法:E8.5-E10.5大鼠胚胎4%多聚甲醛固定6 h,不经蛋白酶K消化;E11.5-E12.5胚胎4%多聚甲醛固定过夜,蛋白酶K系列稀释实验确定消化浓度和时间。E8.5-E12.5胚胎预杂交2 h,地高辛标记的甘油二酯激酶ζ(DGKζ)寡核苷酸探针杂交24 h,山羊血清封闭2.5～3 h,地高辛抗体4℃过夜,冷TBST和NTMT漂洗1～2 h,NBT/BCIP避光显色。应用免疫组织化学方法观察DGKζ在E12.5大鼠胚胎组织的表达。结果:DGKζ在不同胚龄大鼠胚胎均有清晰的杂交信号,主要集中在神经系统;E12.5大鼠胚胎脑泡、背根神经节有较强表达,与免疫组化结果一致。结论:本研究建立了简便、可行、重复性高的E8.5-E12.5大鼠胚胎整体原位杂交方法。

自噬对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖及迁移的影响及机制

目的观察自噬对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的新生大鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblats,CFs)增殖及迁移的影响,并探讨其作用机制。方法消化法培养新生大鼠CFs,AngⅡ诱导新生大鼠CFs增殖,MTT比色法、细胞划痕实验分别检测细胞增殖及迁移情况;Western blot法检测微管相关蛋白轻链3(LC3)、beclin-1及DGKζ蛋白的表达;DGKζshRNA慢病毒感染CFs下调DGKζ蛋白水平,观察其对CFs自噬的影响。结果 AngⅡ10-7mol·L-1明显促进CFs增殖并增加自噬相关蛋白LC3及beclin-1的表达;自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3-MA,5 mmol/L)及氯喹(CQ,5μmol/L)可逆转AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移;AngⅡ诱导CFs增殖的同时DGKζ蛋白表达明显下调;DGKζ下调增加AngⅡ诱导的自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达。结论 AngⅡ通过激活自噬诱导CFs增殖及迁移,其作用机制可能与DGKζ蛋白下降有关。

Chrysin serves as a novel inhibitor of DGKα/FAK interaction to suppress the malignancy of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)

Among current novel druggable targets,proteineprotein interactions(PPIs)are of considerable and growing interest.Diacylglycerol kinase a(DGKα)interacts with focal adhesion kinase(FAK)band 4.1-ezrin-radixin-moesin(FERM)domain to induce the phosphorylation of FAK Tyr397 site and promotes the malignant progression of esophageal squamous cell carcinoma(ESCC)cells.Chrysin is a multi-functional bioactive flavonoid,and possesses potential anticancer activity,whereas little is known about the anticancer activity and exact molecular mechanisms of chrysin in ESCC treatment.In this study,we found that chrysin significantly disrupted the DGKα/FAK signalosome to inhibit FAKcontrolled signaling pathways and the malignant progression of ESCC cells both in vitro and in vivo,whereas produced no toxicity to the normal cells.Molecular validation specifically demonstrated that Asp435 site in the catalytic domain of DGKαcontributed to chrysin-mediated inhibition of the assembly of DGKα/FAK complex.This study has illustrated DGKα/FAK complex as a target of chrysin for the first time,and provided a direction for the development of natural products-derived PPIs inhibitors in tumor treatment.

甘油二酯激酶κ基因多态性与浙江省汉族尿道下裂人群相关性的研究

目的对尿道下裂易感基因甘油二酯激酶κ基因(DGKκ)多态性与浙江省汉族尿道下裂相关性进行研究,探讨其在尿道下裂发病机制中的作用。方法收集2013年1月至2017年12月浙江大学医学院附属儿童医院就诊的553例汉族尿道下裂患儿(322例远端型,148例中端型,83例近端型)和500例门诊行包皮环切手术的男童(术中均确定正常尿道开口,不伴有阴茎下弯等畸形)的外周静脉血(入院后次日清晨抽取空腹肘部静脉血)。将553例汉族尿道下裂患儿作为研究组,将500例进行门诊包皮环切手术男童作为对照组。根据Barcat分型原则,将研究组样本分为中远端尿道下裂组470例(包括322例远端型和148例中端型)和近端尿道下裂组83例,分别与对照组样本进行比较。研究组患儿年龄3月龄至9.5岁,平均4.3岁;对照组年龄3~14岁,平均5.6岁。首先选取与高加索人种尿道下裂相关的SNP位点:rs1934179和rs7063116;同时搜索Hapmap数据库和NCBI数据库中DGKκ基因的单基因多态性位点,按照最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)大于5%的基因位点的原则,挑选出另5个单基因多态性位点作为研究对象,分别为rs2211122、rs4143304、rs5961179、rs7876567和rs4076065,对这7个多态性位点进行基因检测,并利用SPSS软件对检测结果进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果研究组中rs1934179的突变型频率为0.52,其在中远端尿道下裂组的突变型基因频率为0.55,显著高于对照组0.41,组间比较,差异有统计学意义(OR=1.34,P=0.04)。而其他6个位点(rs7063116、rs2211122、rs4143304、rs5961179、rs7876567和rs4076065)基因频数在研究组和对照组间的差异均无统计学意义。结论DGKκ基因多态性可能与浙江省汉族人群的中远端型尿道下裂发生存在联系。