大肠杆菌甲基化缺陷DM1菌株与普通DH5α菌株的感受态转化率的比较

目的观察甲基化缺陷的大肠杆菌DM1菌株与普通DH5α菌株感受态转化效率的差别。方法用常规氯化钙法制备二者的感受态细胞,质粒转化后计算转化率。结果DM1菌株感受态细胞转化率为(2.2±0.3)×106CFU/μg,DH5α菌株感受态细胞转化率为(6.3±0.5)×106CFU/μg。结论成功建立一种高效制备甲基化缺陷菌株DM1感受态细胞的方法,虽然该法制备DM1感受态细胞转化效率比DH5α低2-3倍,但其能够高效满足质粒克隆实验中Dam或Dcm甲基化的限制性位点的使用要求。

TEM-105编码基因的功能研究

目的 获得浙江地区临床分离的 4株肺炎克雷伯菌所产的TEM型β 内酰胺酶编码基因的序列,鉴定其基因型,并了解其相关特性。方法 PCR扩增TEM型β 内酰胺酶编码基因片段,克隆入pGEM Teasy载体,表达于感受态细胞大肠埃希菌DH5α中,双脱氧链终止法测定核苷酸序列,确定基因型;其基因与原核表达载体 (pET 28c)连接,并在感受态细胞大肠埃希菌DH5α中进行原核表达,提取质粒,用PCR进行表达鉴定,用等电聚焦电泳测定原核表达菌株中酶的等电点(pIs),用ESBLs表型确认试验鉴定表达菌株的表型,另外对这些临床菌株进行接合试验。结果 PCR扩增结果显示这 4株细菌产生的TEM型β 内酰胺酶编码基因片段含1 009个核苷酸,其表达酶的性质均为非ESBLs,pIs均为5 4,临床菌株的质粒接合试验均为阳性。这 4株临床菌株所产生的TEM型β 内酰胺酶的编码基因已被GenBank命名为TEM 105(GenBank注册号:AF516720)。结论 浙江地区这 4株细菌所产TEM型β 内酰胺酶均为TEM 105,在世界上我们首次从临床分离株中发现TEM 105。

人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体转染椎间盘正常髓核细胞

背景:椎间盘髓核细胞分离培养困难,老化较快,迫切需要一种标准细胞株用于实验研究。目的:探讨人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体的构建及其转染正常髓核细胞构建永生化细胞的可行性研究。方法:通过目的基因克隆、真核表达质粒中目的基因序列测定、目的基因真核表达质粒的构建、转染人端粒酶反转录酶表达检测等步骤进行实验。结果与结论:构建出人端粒酶反转录酶重组绿色荧光表达载体,成功转染正常髓核细胞并在细胞中稳定表达。结果表明运用人端粒酶反转录酶转染椎间盘髓核细胞构建永生化细胞是一种可行的方法。

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。

低温培养对大肠杆菌电穿孔转化效率的影响

在18℃和37℃振荡培养大肠杆菌DH5α并制备感受态细胞,用Eppendorf公司的Multiporator电转移仪进行电穿孔转化,研究了培养温度对转化效率的影响.实验结果表明,低温(18℃)培养的细菌,回收时的OD600值在0.5～1.0时,转化效率都维持在高水平;而在37℃培养的细菌,转化效率仅在OD600 0.6～0.7时出现一个锐利的峰值,此OD600值前后转化效率显著下降.在不影响细胞生长的情况下,18℃培养细菌的转化效率随电场强度增加而升高;而37℃培养的细菌在电场强度超过20.5 kV/cm时转化效率将大幅度下降.另外,还对影响转化效率的其他因素(培养基、振荡培养时的转速、细胞密度、质粒浓度、电击前后冰浴时间等)进行了优化,建立了一个便利而高效的质粒DNA电转化方法,获得1.02×1010cfu/μg DNA的高转化效率.

小鼠PPARδ基因表达载体pCMV-PPARδ的转化扩增

取含鼠过氧化物酶体增殖物激活受体δ(mPPARδ)基因载体pCMV-PPARδ质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含卡那霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养。结果转化的DH5α菌在含卡那霉素的琼脂平板上呈克隆样生长,经LB液体培养基培养后提取的pCMV-PPARδ质粒其A260/A280=1.88,浓度为560 ng/μl。提示本研究成功转化并扩增了pCMV-PPARδ质粒,为PPARδ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。

人KLF4基因克隆及重组KLF4慢病毒表达载体的构建

背景:KLF4基因在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建KLF4基因慢病毒过表达载体。方法:聚合酶链反应扩增(PCR)目的基因KLF4后插入慢病毒表达载体pCDH中,构建重组载体pCDH-KLF4。通过PCR、双酶切和DNA测序方法对其鉴定,共同转染293NT细胞包装病毒,荧光显微镜观察报告基因的表达情况,收集病毒上清,测定病毒的滴度。将重组的慢病毒感染5637细胞,RT-PCR检测KLF4mRNA的表达。结果与结论:重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实重组慢病毒载体pCDH-KLF4的插入序列完全正确,重组慢病毒载体感染5637细胞后,细胞内KLF4mRNA高表达。结果证实,实验成功构建KLF4基因慢病毒过表达载体。

小鼠PPARγ2基因表达载体pcDNA3-PPARγ2的转化扩增

目的对含小鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(mPPARγ2)基因载体pcDNA3-PPARγ2进行体外转化和扩增,为基于PPARγ2的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-PPARγ2质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,紫外分光光度计测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-PPARγ2质粒其A260/A280=1.89,浓度为420 ng/μl。结论成功转化并扩增了pcDNA3-PPARγ2质粒,为PPARγ的相关研究提供了高纯度、高浓度的表达载体。

日本血吸虫(大陆株)Sj26基因的克隆与序列分析

目的构建日本血吸虫 (大陆株 ) 2 6kDa谷胱甘肽 S 转移酶 (Sj2 6 )基因的真核表达载体 ,并测定基因序列和进行序列分析。方法用PCR的方法特异性地扩增Sj2 6基因 ,并将此基因克隆于真核表达载体pcDN3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,阳性克隆的重组质粒DNA经酶切、PCR扩增鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,应用BLAST方法分析Sj2 6基因序列并进行同源性比较。。结果PCR扩增得到特异的Sj2 6基因 ,双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3 Sj2 6重组质粒 ,测序结果获得的基因片段大小为 6 5 1bp ,编码 2 17个氨基酸残基。基因序列同源性为 99%。结论成功构建真核表达重组质粒pcDNA3 Sj2 6。

野生型大鼠Rab5a基因表达载体pcDNA3-Rab5(a)WT的转化扩增及鉴定

目的对含野生型大鼠Rab5a基因载体pcDNA3-Rab5(a)WT进行体外转化、扩增及鉴定,为基于Rab5a的相关研究提供高纯度、高丰度的表达载体。方法取pcDNA3-Rab5(a)WT质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选,对挑取的阳性克隆进行LB液体培养基培养后抽提质粒,用超微量核酸蛋白测定仪测定提取质粒的纯度和浓度,并取样进行琼脂糖凝胶电泳及PCR鉴定。结果经转化后获得了大量抗氨苄青霉素的阳性克隆菌落,挑取阳性克隆并经培养后提取的pcDNA3-Rab5(a)WT质粒均为浓度高、纯度高、超螺旋结构为主的质粒。pcDNA3-Rab5(a)WT经PCR后得到Rab5a基因。结论成功转化并扩增了pcDNA3-Rab5(a)WT,为Rab5的相关研究提供了高质量的表达载体。