青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。

DHAR与草莓AsA积累关系及DHAR RNAi遗传转化研究

【目的】确定草莓脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)酶活性与抗坏血酸(ASA)的关系,研究DHAR对AsA积累的调控作用,为筛选高AsA草莓品种育种提供理论基础。【方法】于不同时期测定草莓果实AsA含量和DHAR酶活性并进行相关性分析,构建DHAR基因RNAi植物表达载体,通过农杆菌介导法,将RNAi植物表达载体导入草莓中。【结果】草莓果实成熟过程中AsA含量呈现上升趋势,生长后期含量增幅最大。随着草莓果实的成熟,DHAR酶活性逐渐增大,在生长后期酶活性最高。构建了脱氢抗坏血酸酶基因(DHAR)的RNAi植物表达载体(Part27-IDHAR),并采用农杆菌介导法转入草莓,共获7株PCR阳性植株,初步说明目的基因已整合到草莓组织中。【结论】DHAR酶活性与AsA积累呈显著正相关,获得的转基因植株可为下一步研究提供植物材料。

棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。

草莓DHAR基因密码子偏好性分析

以草莓为试材,运用CHIPS、CUSP和CodonW程序分析了草莓DHAR基因的密码子偏好性,并与大肠杆菌和酵母的基因组密码子偏好性及7种植物的DHAR基因密码子偏好性进行了比较,同时基于DHAR基因的密码子使用偏好性进行了系统聚类分析,以期在作物遗传改良中为草莓DHAR基因选择合适的遗传转化受体及进行基因优化提供依据。结果表明:草莓DHAR基因更适合导入苹果等双子叶植物中,若要提高草莓DHAR基因在大肠杆菌或酵母中的表达水平,还需进行密码子的优化。

DHAR基因植物表达双元载体的构建及转化百合研究

将质粒pSB166中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1303,构建了中间表达载体,将DHAR基因与pCSB定向连接,构建了DHAR基因植物表达载体pCSB-DHAR。进而以百合叶片为受体,通过根癌农杆菌介导的方法将DHAR基因转入百合,对转基因百合进行PCR检测,初步表明DHAR基因已整合到百合基因组中。

棉花GhDHAR3基因克隆、功能序列分析及烟草的遗传转化

对棉花EST数据库进行同源搜索、比对和序列拼接,经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR3的cDNA,其开放阅读框为792bp,编码由263个氨基酸组成的蛋白质。同源性比对分析显示GhDHAR3蛋白具有较高的保守性,进化树分析表明其与拟南芥AtDHAR3亲缘关系较近。利用软件进行蛋白质序列分析,GhDHAR3蛋白具有GST-N家族和GST-C-DHAR典型的结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族。将GhDHAR3基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中,利用农杆菌通过叶盘法转化烟草,经PCR分子鉴定,获得了含GhDHAR3转基因烟草植株。首次克隆棉花DHAR基因,通过结构域分析其可能的作用并成功转化烟草。

植物脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)研究进展

脱氢抗坏血酸还原酶是AsA-GSH循环中能够促进抗坏血酸再生的关键酶。文章从植物脱氢抗坏血酸还原酶的发现、功能及分子生物学等方面的研究进展作一综述,以期为该酶的深入研究及其合理利用提供参考。

小麦DHAR基因的克隆及生物信息学分析

以电子克隆和RT-PCR克隆获得了1个小麦脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,并对其编码的蛋白质序列进行了生物信息学分析。结果表明,该基因cDNA序列长1 187bp,编码263个氨基酸,蛋白质分子量为28 908.2Da,PI为6.84;具有GST-N家族和GST-C-DHAR结构域,分别属于硫氧还蛋白超家族和GST-C末端超家族;该蛋白序列无信号肽,是亲水性蛋白,定位于细胞质叶绿体中,二级结构中以无规则卷曲(40.30%)和α螺旋(37.64%)为主,并含有少量的片层结构(17.11%);该蛋白序列与大麦、二穗短柄草、玉米、水稻、拟南芥的同源蛋白序列相似性较高,其中与大麦胞质DHAR(BAJ97007.1)蛋白进化距离最近。

苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因cDNA片段的克隆及序列分析

以皇家嘎拉苹果叶片为材料提取总RNA,合成cDNA第一链后,先利用巢式PCR获得苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因中间片段,再利用3-′RACE方法进一步获得3′末端核酸序列,共得到840 bp包含完整3′末端的DHAR基因cDNA片段,其序列与烟草、水稻、番茄中DHAR基因序列的同源性均大于70%,证明所克隆到的核苷酸片段确为苹果DHAR基因cDNA片段。

甘蓝型油菜BnDHAR基因的克隆及表达分析

在甘蓝型油菜矮化突变体与其高秆亲本构建的消减杂交文库中,得到一长约230bp与编码脱氢抗坏血酸还原酶的DHAR基因核苷酸序列相似的DNA片段.采用同源克隆技术,在甘蓝型油菜中获得该基因的全长cDNA序列,命名为BnDHAR.BnDHAR与已公布的甘蓝型油菜基因组中的该基因核苷酸序列完全一致.对BnDHAR基因不同发育时期组织的表达分析的结果显示,BnDHAR基因在高秆油菜苗期的叶中表达量最高,是矮化突变体的5倍,在根、茎中表达极低,具有组织特异性.非生物胁迫显著影响BnDHAR表达,高温胁迫使其表达升高,盐胁迫处理9h时达最高,而干旱胁迫时表达量在处理12h时才达最高.

橡胶树HbDHAR2基因克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)通过调节抗坏血酸水平在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用。为明确橡胶树DHAR基因的序列特征、表达特性以及潜在的生物学功能,采用RT-PCR技术,从橡胶树中克隆了DHAR基因HbDHAR2。该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸。预测HbDHAR2蛋白等电点为5.69,分子量为23.82 ku,是一个亲水蛋白。HbDHAR2蛋白含有谷胱甘肽S-转移酶(GST)N-端结构域和GST C-端DHAR结构域,属于GST超家族DHAR亚类。序列比对表明,HbDHAR2与木薯MeDHAR2和蓖麻RcDHAR2具有很高的一致性。组织表达谱分析显示,HbDHAR2在根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、嫩梢、雌花和雄花中均有表达,其中表达量最高的组织为嫩梢,表达量最低的组织为根。乙烯利(ETH)、茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)、过氧化氢(H2O2)、甲基紫精(MV)、低温、干旱和高盐等处理均能诱导HbDHAR2的表达。由此推测,HbDHAR2可能在橡胶树抵御非生物胁迫过程中发挥作用。结果为进一步研究橡胶树HbDHAR2基因的功能奠定了基础。

ApDHAR基因的克隆与RT-qPCR 检测

在柞蚕体内,由其他昆虫脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)序列设计引物,克隆得到ApDHAR基因。并运用RT-qPCR方法,在体外注射维生素C条件下,测定该基因在4龄柞蚕幼虫体内表达量的变化,初步检验该基因的功能,以期为研究柞蚕维生素C代谢的分子机理提供帮助。

刺梨GGP和DHAR基因序列多态性及其与果实维生素C含量的关联分析

高含量的维生素C是刺梨果实的重要性状,挖掘与维生素C含量相关联的基因序列变异及单倍型对刺梨的品种改良具有指导意义。在21份野生刺梨资源中对GGP和DHAR基因进行PCR扩增和测序,分析基因序列多态性及其与果实维生素C含量的相关性。GGP基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为2035 bp的同源序列,其中包含22处变异位点,产生15种单倍型,在0.01显著性水平上,3个单核苷酸多态性(SNP)及Hap15与刺梨果实高含量维生素C相关;在0.05显著性水平上,3个SNP及Hap7与刺梨果实低含量维生素C相关;GGP基因单倍型存在网状进化。DHAR基因在21份野生刺梨中共扩增出长度为1609 bp的同源序列,其中包含69处变异位点,产生9种单倍型,在0.05显著性水平上,8个SNP、9个InDel及Hap9与刺梨果实中低含量维生素C相关,1个SNP及单倍型Hap4~Hap6与刺梨果实中高含量维生素C相关;DHAR基因单倍型呈现扇形进化。GGP基因具有更高的单倍型多样性,DHAR基因具有更高的DNA多态性;GGP基因特异单倍型Hap15和DHAR基因特异单倍型Hap4共同存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为高的状态;而GGP基因特异单倍型Hap7和DHAR基因单倍型Hap9同时存在于刺梨中时,可以使果实维生素C含量表现为低的状态。

条锈菌侵染慢锈性小麦品种川麦107后的蛋白质组学分析

为了在基因和蛋白表达水平上研究小麦的慢条锈性机制,运用双向电泳技术分析了条锈菌侵染的2个小麦品种(川麦107和80-8)的对照和发病14 d叶片的差异表达蛋白,从2-D图谱上找到9个差异表达蛋白,其中点P5是在接种并发病的川麦107中新诱导出的一个差异蛋白质。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)获得6个蛋白质的肽指纹图谱(PMF),数据库搜索鉴定出2个蛋白质。这2个蛋白质是磷酸核酮糖激酶(Phosphoribulokinase,PRK)和脱氢抗坏血酸还原酶(Dehydroascorbate re-ductase,DHAR)。

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸。通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性。结果表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径。

猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶和脱氢抗坏血酸还原酶cDNA片段的克隆与序列分析

克隆猕猴桃果实L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因,可为揭示猕猴桃高抗坏血酸(AsA)含量的分子机制奠定基础。研究以猕猴桃果实为材料提取总RNA,采用RT-PCR法,克隆出L-GalLDH基因的cDNA片段857 bp和DHAR基因的cDNA片段594 bp并测序,根据测序结果推测其氨基酸序列,并与刺梨、拟南芥、花椰菜、甘薯和草莓等植物的GalLDH基因和DHAR基因氨基酸序列进行亲缘分析。结果表明,猕猴桃GalLDH基因氨基酸序列和核苷酸序列与刺梨的相似性高达88%,其在同源基因进化关系树中单独聚为一类;DHAR基因氨基酸序列和核苷酸序列与苹果的相似性高达98%和99%,两者在进化关系上聚为一类。可知克隆到的2个核苷酸片段确为猕猴桃L-GalLDH和DHAR基因cDNA片段,同源基因植物亲缘关系聚类与传统的形态分类有一定的差异。

兰州百合基因枪转化方法的研究

以兰州百合试管苗鳞片叶为受体,通过基因枪转化法将脱氢抗坏血酸还原酶基因(DHAR)转入兰州百合,并用GUS染色、PCR扩增和Southern杂交等技术进行转基因株系的检测.结果表明:以兰州百合鳞片叶为受体材料,在轰击压力1 100 psi、轰击距离6 cm时,抗性率高达14%,转化率为1.5%;10 mg/L的潮霉素对鳞片叶具有很好筛选作用.GUS分析发现,转化株系叶片为蓝色;PCR检测和Southern杂交进一步证实抗性株系为转基因植株,且为单拷贝.

高效液相色谱法同时测定水果蔬菜中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、脱氢抗坏血酸及总维生素C的含量

建立了同时测定水果或蔬菜中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸、脱氢抗坏血酸及总维生素C含量的高效液相色谱分析方法。用偏磷酸提取水果或蔬菜样品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸和脱氢抗坏血酸,提取液中的L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸可直接进行检测,脱氢抗坏血酸在磷酸钠溶液中（pH 7.0-7.2）用L-半胱氨酸还原成L-抗坏血酸,之后测定以L-抗坏血酸表达总维生素C含量,脱氢抗坏血酸含量由总维生素C含量减去L-抗坏血酸含量获得。采用C18色谱柱分离,以甲醇-磷酸盐缓冲溶液（pH 3.5）为流动相,在245 nm下检测,外标法定量。结果表明,在0.5-50 mg/L的浓度范围内L-抗坏血酸和D-异抗坏血酸的线性关系良好,相关系数大于0.999,检出限分别为42.0,19.4μg/kg,脱氢抗坏血酸的检出限为262μg/kg。低、中、高3个浓度的加标水平下,3种物质的加标回收率为82.8%-111.3%,相对标准偏差（RSD）小于15%。该方法操作简单,灵敏度高,准确性好,适用于水果和蔬菜中维生素C的测定。

山楂加工中还原型V_C和氧化型V_C含量变化的研究

目的研究山楂加工过程中还原型VC和氧化型VC含量的变化。方法通过观测山楂打浆、糖煮和干燥工序中还原型VC和氧化型VC含量的变化,来研究其变化规律。结果应用EDTA二钠和茶多酚处理能控制打浆中还原型VC损失,添加六偏磷酸钠可控制氧化型VC损失。真空糖煮比常压糖煮有利于山楂还原型VC含量的保持,但对氧化型VC含量影响不大。干燥对山楂还原型VC与氧化型VC含量均有显著影响。真空干燥和微波干燥有利于山楂还原型VC含量的保持。结论山楂果实含有较多的氧化型VC,其在加工过程中变化较明显,对山楂制品的总VC含量有显著影响。

玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究

通过电子克隆方法得到玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为ZmDHAR1。结果显示,ZmDHAR1基因全长723bp,开放阅读框642bp,编码214个氨基酸。ZmDHAR1基因与高粱、水稻及小麦等植物的脱氢抗坏血酸还原酶基因高度相似,其中与高粱的DHAR基因相似性为85%,与水稻的DHAR1基因相似性为83%。基因表达分析显示,ZmDHAR1基因在根以外的其他部位都可以检测到表达,而且ZmDHAR1基因可以在4℃低温、100μmol/L ABA、100mmol/L PEG、250mmol/L NaCl和机械损伤等多种逆境胁迫下均可应答表达。研究表明,ZmDHAR1基因可能在玉米抗逆境胁迫反应中发挥重要的作用。