棉花GhDHAR2基因克隆、功能序列分析及原核表达

通过RT-PCR方法从棉花纤维组织中克隆得到脱氢抗坏血酸还原酶基因GhDHAR2的cDNA,该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸的蛋白质。同源性序列对比分析显示,GhDHAR2蛋白具有较高的保守性,具有典型的功能结构域,包括GST-N家族和GST-C-DHAR家族的功能结构域;进化树分析显示GhDHAR2和拟南芥AtDHAR2在进化关系上较近。将GhDHAR2基因连接到原核表达载体pET-28a中,将重组载体pET28a-GhDHAR2转入到表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达出重组GhDHAR2蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析显示重组蛋白大小约为28 kD,诱导表达的重组蛋白具有较高的DHAR活性。首次克隆了棉花GhDHAR2基因,通过结构域分析其可能的作用,并成功进行蛋白体外表达及酶活性分析。

3种小麦DHAR蛋白高级结构建模与功能分析

为揭示小麦脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)的序列特征与其结构和功能的关系,利用DNAman软件比较了小麦3个DHAR基因(Ta DHAR1/2/3)和蛋白质序列特性,利用生物信息软件对蛋白质结构域、亚细胞定位、谷胱甘肽结合位点、N-末端结构域和C-末端结构域界面残基和二级结构进行了预测,并对蛋白质三级结构、表面电位和可及性的空间分布进行了模建和比较。结果表明,小麦Ta DHAR1和Ta DHAR2蛋白质序列长度一致,均定位于细胞质中,仅存在2个氨基酸残基差异,具有完全一致的保守结构域和三级结构;Ta DHAR3定位于线粒体中,与前2者在核酸与蛋白质序列上差异较大,但其保守域、谷胱甘肽结合位点氨基酸残基、假定的N-末端结构域界面残基和C末端结构域界面残基与前2者几乎完全一致,因此,3者可能执行相同的功能。模建的Ta DHAR1/2/3的三级结构均符合立体化学品质规则,其中Ta DHAR1/2的N端形成βαβαββα结构,Ta DHAR3的N端可能形成αββαβαβββ结构,3者在C端均形成β束结构,属于α+β球形蛋白。Ta DHAR1/2蛋白质的空间结构表面基本呈现负电分布,同时也分布着一些较小的正电集团,而Ta DHAR3蛋白质的空间结构表面整体上为均匀负电分布,基本不存在正电,3种小麦DHAR蛋白质表面的氨基酸残基可及性较强,内部可及性相对较弱。本研究有助于理解小麦DHAR蛋白的功能。

高山松及其亲本种油松和云南松DHAR基因的功能分化

高山松(Pinus densata)是油松(P.tabulaeformis)与云南松(P.yunnanensis)自然杂交产生的同倍性杂种,分布于青藏高原东南缘,占据了油松和云南松两个亲本种都不能正常生长的高海拔地带。为了揭示高山松、油松和云南松脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因的组成和功能分化,分别从高山松、油松和云南松中克隆到2类DHAR基因(DHAR1与DHAR2)。组织表达模式分析表明,这6个基因在根、韧皮部、叶和芽中均有表达;通过系统发育分析发现,高山松在物种形成过程中保留了油松的DHAR1拷贝以及云南松的DHAR2拷贝;酶学性质分析则表明,高山松与油松DHAR1蛋白对底物具有相似的催化活性、催化效率、最适pH和热力学稳定性,但其催化活性比云南松DHAR1蛋白高约300倍。高山松DHAR2蛋白对底物的催化活性和热力学稳定性均高于油松DHAR2蛋白。高山松DHAR基因在生化功能上显示出优于或类似亲本DHAR,这种优势功能的选择与杂种独特的生态适应性可能有重要的相关性。

江南卷柏脱氢抗坏血酸还原酶的分子特性

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)在植物抗坏血酸?谷胱甘肽循环中发挥着重要作用。利用同源克隆技术从江南卷柏中克隆到2个脱氢抗坏血酸还原酶基因,分别命名为SmDHAR1和SmDHAR2。SmDHAR1和SmDHAR2分别编码218和241个氨基酸,预测分子量分别是23.97 kDa和27.33 kDa。基因组序列分析显示这2个基因分别含有5和6个内含子。器官表达模式分析发现这2个基因在根、茎、叶中均有表达,是组成型表达基因。在大肠杆菌中表达并纯化了2个基因的重组蛋白。酶活性分析显示SmDHAR1和SmDHAR2蛋白对底物DHA的活性有显著差异,分别是19.76和0.17μmol/(min.mg)。热力学稳定性分析显示这2个重组蛋白的热力学稳定性具有明显差异。因此,基因结构与酶学性质的差异预示着这2个基因可能存在功能上的分化。