易感和抗性北京鸭感染DHAV-3后血浆生化指标的动态变化研究

为探究北京鸭感染基因3型鸭甲肝病毒后血浆生化指标的变化规律,本试验用DHAV-3112803毒株同时感染7日龄的DHAV-3易感鸭和DHAV-3抗性鸭,并测定感染前(0 h)和感染后6、12、18、24、30、36、42 h时葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶/谷丙转氨酶(AST/ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)、尿酸(UA)和肌酐(CREA)等15项血浆生化指标。研究发现:在抗性品系中,LDL-C、HDL-C、ALT和ALB水平在6 h内降低之后保持稳定,LDH、AST和TBIL水平在6 h先升高后缓慢降低并保持稳定,GLU、TC、UA和DBIL快速上升后保持稳定,而CREA、TP和ALP变化不大。在易感品系中,CREA、DBIL、TBIL、LDH、ALT和AST水平在感染后12 h或18 h后显著升高,30 h后逐渐降低,但总体水平仍高于相应时间点的抗性品系。其他生化指标的变化趋势在2个品系中的结果类似,表明DHAV-3对易感品系的肝脏和肾脏等器官有明显的损伤作用,而抗性品系对DHAV-3有较好的抵抗性。综上,CREA、DBIL、TBIL、LDH、ALT和AST水平可能作为判断北京鸭感染DHAV-3后其对DHAV-3抗性和易感的分子标志物。

北京鸭DHAV-3抗性与易感品系的脂质轮廓鉴定与分析

【目的】试验旨在研究抗鸭甲肝病毒基因3型(Duck hepatitis A virus genotype 3,DHAV-3)的北京鸭专门化品系(即抗性品系Z7-R)与DHAV-3易感品系(Z7-S)的脂质代谢轮廓,并筛选品系间差异脂质标志物。【方法】选取2日龄Z7系DHAV-3抗性北京鸭和易感北京鸭各6只,采集血液与肝脏组织,进行血液生化指标测定与基于液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)的非靶向肝脏脂质组检测。采用t检验、偏最小二乘分析(PLS-DA)和差异倍数(FC)综合筛选品系间显著差异脂质。【结果】Z7-R系北京鸭血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和磷脂含量均显著高于Z7-S系(P<0.05)。脂质组分析共鉴定到1 532个脂质代谢物,涵盖了脂肪酰(FA)、甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)、鞘脂(SP)、固醇脂(ST)5个大类。共筛选到84个显著差异脂质,其中甘油酯类主要为甘油三酯(TG),且Z7-R系含量均高于Z7-S系(P<0.05);甘油磷脂类主要为溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)和游离脂肪酸(FFAs),且Z7-R系含量均低于Z7-S系(P<0.05)。共筛选到10个显著差异的脂质显著富集到鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、甘油酯代谢、亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢通路中。【结论】脂质组学技术可用于区分北京鸭Z7-R系与Z7-S系,筛选到的10个显著差异脂质物质可作为潜在的DHAV-3抗性与易感性状相关生物标志物。

鸭甲型肝炎病毒3型对商品肉鸭的致病性研究

为了解鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)对商品肉鸭的致病性,利用DHAV-3型强毒株SD20株滴口接种10日龄雏鸭,对攻毒后死亡雏鸭的组织病变进行了观察,并对攻毒后24和48 h雏鸭的血清生化指标进行了测定。结果显示:DHAV-3对雏鸭的致死率达85%,对肝脏等组织造成广泛的病理损伤,同时严重影响感染肉鸭的血清生化指标。攻毒后24 h,鸭血清中直接胆红素显著性降低(P<0.05),γ-谷氨酰转移酶和肌酐显著性升高(P<0.05);攻毒后48 h,鸭血清中白蛋白、直接胆红素显著升高(P<0.05),白球比、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、γ-谷氨酰转移酶、尿素氮和肌酐均极显著升高(P<0.01),谷丙/谷草和血糖均极显著下降(P<0.01),而总蛋白、球蛋白、总胆红素、间接胆红素、碱性磷酸酶指标变化不显著(P>0.05)。研究结果提示,DHAV-3对商品肉鸭致病性较强,养殖过程中需要积极预防。

3型鸭甲型肝炎病毒逆转录环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

为建立一种3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的快速检测方法,本研究针对DHAV-3 VP1基因序列中的8个不同区段设计了3对特异性引物,并对反应体系进行优化,通过加入羟基萘酚蓝(HNB)实现对反应结果的可视化观察,建立了检测DHAV-3的逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)方法,采用已建立的方法对人工感染雏鸭的血清样品和病死鸭肝组织样品提取的核酸进行了检测。结果显示,该方法仅对DHAV-3的RNA进行扩增,而对1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)以及鸭常见的病原RNA均无扩增反应;可以检测出10拷贝/μL的DHAV-3 RNA,其敏感性为RT-PCR的1 000倍;最低能够检测到相当于1.1个DELD50的DHAV-3;能够检测到人工感染雏鸭血清和病死鸭肝组织中的DHAV-3;上述结果表明该方法能够特异、灵敏、快速地检测DHAV-3,而且使用方便。

一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道

自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒,命名为TA1和TA2,分离毒分别回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)特异性引物进行RT-PCR扩增,结果为阳性,经测序证实为DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因,经序列测定及遗传进化关系分析发现,分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-3遗传距离最近,属于基因C型;分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性,与DHAV-1的遗传距离最近,属基因A型。

抗甲肝3型病毒北京鸭选育初探

为了培育抗甲肝3型(DHAV-3)病毒北京鸭新品系,本实验以F_0代北京鸭为基础群体进行人工感染,然后将高生存率家系的公母鸭作为F_1代试验组的亲本。统计两代的死亡情况,并比较两代的DHAV-3检出率。结果表明:F_0代的88个家系中生存率为100%的家系有9个,生存率为0%的家系有14个。F_0代总生存率为40.96%。F_1代试验组的生存率为97.78%,极显著高于F_0代试验组的生存率(P<0.01)。F_0代DHAV-3的检出率高于F_1代。表明通过遗传选择能提高北京鸭对肝炎病毒的抗性,为下一步大规模抗DHAV-3北京鸭育种提供可参考的依据。

血清1型和3型鸭甲型肝炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)的基因序列,设计了2对特异性引物,分别建立检测鸭甲型肝炎病毒血清1型(DHAV-1)和鸭甲型肝炎病毒血清3型(DHAV-3)的RT-PCR方法。通过对PCR扩增条件优化建立了鉴别血清1型和血清3型DHAV的二重RT-PCR检测方法,DHAV-1和DHAV-3目的片段大小分别为751bp和448bp,而且对其他禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验表明该检测方法最低检测量为10 pg的DHAV-1和8 pg的DHAV-3模板。因此,本研究建立的二重RT-PCR检测方法可用于DHAV-1和DHAV-3感染的临床样品的快速鉴别诊断。

DHAV-3 VP1蛋白优势抗原区的初步鉴定

为了研究鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)VP1蛋白的优势抗原区,试验根据DHAV-3 VP1基因序列设计4对特异性表达引物,用PCR获得VP1-a^d基因片段,并在p ET-30a(+)/Rosetta(DE3)p LysS系统中进行原核表达;经IPTG诱导重组蛋白获得表达,用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白;同时以DHAV-3病毒为免疫原制备鼠抗DHAV-3多克隆抗体,通过I-ELISA和Westernblot初步鉴定。结果表明:p ET-30a-VP1-a、p ET-30a-VP1-b、p ET-30a-VP1-c和p ET-30a-VP1-d与鼠抗DHAV-3多克隆抗体都发生反应,抗原量相同的情况下VP1-c和VP1-d段显色较VP1-a和VP1-b深,说明这两段反应性相对较强;4种截短蛋白与鸭抗DHAV-3阳性血清进行反应,只有p ET-30a-VP1-c显色。说明VP1-c免疫原性较强,DHAV-3 VP1蛋白的90~175 aa为其优势抗原区。

鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

为建立一种切实可行的鸭甲肝病毒抗体的检测方法,将1株临床分离的3型鸭甲肝病毒的VP 3基因进行原核表达的纯化蛋白作为包被抗原,初步建立了检测鸭肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。通过条件优化,得到VP3蛋白最佳包被浓度为0.1595μg/mL,血清最佳稀释倍数为1∶200。结果显示,建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,与商品化的双抗原夹心ELISA的符合率为92.5%,且该方法可同时检测1型和3型鸭甲肝病毒抗体,因而可用于临床免疫鸭甲肝病毒的种鸭血清抗体水平的检测和卵黄抗体的效价测定。

鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析

为揭示近年来鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)中国分离株VP1基因的遗传变异规律,本研究对2012年从山东省分离到的13株DHAV-3的VP1基因分别进行PCR扩增、序列测序与分析。结果显示,13株DHAV-3的VP1基因均由720个核苷酸组成,共编码240个氨基酸,核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为94.6%～99.9%和95.0%～100%。与GenBank中公布的31株DHAV-3的VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.5%～100%和90.8%～100%。系统进化分析显示,DHAV-3可分为两个基因型,其中除疫苗毒B63之外所有中国分离株均属于GⅠ型,越南分离毒株主要属于GⅡ型S1亚型,而韩国分离株组成GⅡ型中的S2亚型,具有明显的地域特征。

表达1型和3型鸭甲型肝炎病毒VP1基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性

为进一步研发安全有效的鸭甲型肝炎病毒(DHAV)多价疫苗,本研究以新城疫病毒(NDV)LaSota弱毒疫苗株为载体,构建出共表达DHAV-1和-3型VP1基因的重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1,并对其毒力、生物学特性进行鉴定。通过间接免疫荧光试验(IFA)验证DHAV-1和-3型VP1蛋白在细胞内能够有效表达。利用Western blot进一步验证重组病毒产生的中和抗体能和DHAV-1和DHAV-3VP1表达蛋白发生较强的反应。重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1保持了原重组疫苗株rLS-RFP对鸡胚的高滴度生长适应和低致病的特性。将重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1免疫种鸭1次,通过中和试验检测该重组病毒能够在鸭体内产生针对DHAV-1和DHAV-3的中和抗体,平均效价分别为1∶18.17和1∶16.60。本研究结果表明重组病毒rLS-1VP1-2A-3VP1具有作为鸭肝炎重组病毒活载体疫苗用于种鸭的潜力。

鸭甲肝病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在雏鸭体内分布规律

为研究鸭甲肝病毒3型（DHAV-3）在雏鸭体内的动态分布情况,本研究建立了检测DHAV-3的Taqman荧光定量PCR方法,该方法在107-102范围内有良好的线性关系,相关系数0.997,检测下限为22copies/PCR。将200只2日龄雏鸭随机分为4组,依次对每组雏鸭肌肉注射0.2ELD50、2ELD50、20ELD50的DHAV-3（SD1201株）和生理盐水,并于感染后1、2、6、12、18、24、36、48、72、96h从各组分别随机取3只雏鸭,应用荧光定量PCR方法对其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊的病毒含量进行检测。结果表明,DHAV-3于感染后1h即可在3个试验组雏鸭肝脏中检测到,病毒含量为102-103 copies/g,2h后在心脏、脾脏、肾脏、胸腺和法氏囊中均检测到该病毒。各器官中的病毒含量于感染后36-48h达到高峰期,至72h病毒含量仍维持稳定。此外,在整个感染过程中,被检器官中的病毒含量与初始感染剂量呈正相关。本研究结果有助于阐明DHAV-3的致病机理。