HPV16 E6 下调 DHRS2 表达可介导宫颈上皮细胞的致癌转化

目的探讨HPV16 E6对宫颈上皮细胞基因及信号通路的影响,筛选与致癌转化相关的基因。方法构建HPV16 E6感染的正常人宫颈上皮细胞(HUCEC)模型,进行转录组测序筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),并进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析差异信号通路。采用RT-qPCR验证主要差异下调表达基因。对主要差异基因的蛋白结构与HPV16 E6蛋白进行分子对接预测分析,通过RT-qPCR及Western blot验证HUCEC细胞模型中主要差异基因表达情况,并采用RT-qPCR及Western blot实验在宫颈癌细胞系SiHa及CaSki中进一步验证差异基因的表达。结果共筛选出差异表达2倍以上的基因55个。本研究聚焦下调差异基因,结果表明:负调控的差异基因GO功能富集于氧化还原过程;KEGG富集分析主要与碳水化合物代谢及癌症等相关。10个差异基因mRNA下调表达趋势与测序结果基本一致。分子对接预测DHRS2与HPV16 E6蛋白存在相互作用。与对照组比较,HUCEC细胞模型中HPV16 E6下调DHRS2的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)、ETV5的蛋白(P<0.01)表达;在SiHa、CaSki细胞系中,与对照组比较,DHRS2的mRNA及蛋白表达亦明显下调(P<0.05),并与P53蛋白表达趋势正相关。结论HPV16 E6可能通过下调DHRS2表达介导宫颈细胞致癌转化,促进宫颈癌发生。

DHRS2蛋白对结直肠癌细胞化疗敏感性的影响

目的研究DHRS2蛋白对肠癌耐药细胞敏感性影响及其机制。方法利用串联质谱标签法(TMT)对结直肠癌耐药细胞系HCT116/OXA与其亲本进行差异蛋白筛选;CCK-C法检测结直肠癌耐药细胞株HCT116/OXA对奥沙利钳敏感性及沉默DHRS2蛋白对其耐药性影响;蛋白质印迹法验证差异表达蛋白以及检测沉默DHRS2蛋白后对相关信号通路蛋白调节作用。结果耐药细胞株HCT116/OXA中DHRS2蛋白水平明显高于亲本细胞株(P<0.001);沉默DHRS2蛋白可增加HCT116/OXA对奥沙利钳的敏感性;同时下调P53蛋白和切除修复交叉互补基1(ERCC1)蛋白的表达。此外,干扰P53蛋白后,ERCC1蛋白表达也明显减少。结论沉默DHRS2蛋白可部分恢复结直肠癌耐药细胞株HCT116/OXA对化疗药物敏感性,其机制可能为通过下调P53蛋白进而抑制ERCC1蛋白表达引起。

DHRS4L2非编码RNA调控CPNE6基因表达（英文）

DHRS4/NRDR基因编码一种属于SDR家族的酶,在维甲酸合成、类固醇代谢和苯甲基代谢中发挥生物合成催化作用.DHRS4基因定位于14q11.2,有两个相似的拷贝基因,分别为DHRS4L2和DHRS4L1.我们前期发现了DHRS4L2基因一个上游转录起始位点,命名为DHRS4L2-Ea.在本研究中,我们用RT-PCR和双脱氧测序法发现一个新的从DHRS4L2-Ea转录的选择性剪接亚型DHRS4L2-900a(KC237374).同时RT-PCR结果显示在SK-N-SH细胞DHRS4L2-Ea选择性剪接亚型中DHRS4L2-iso(AY616183)表达最多,为主要亚型.在SK-N-SH细胞过表达DHRS4L2-800a(AY920361)使DHRS4L2-Ea基因下游CPNE6 mRNA表达下调.在HeLa细胞过表达DHRS4L2-800a(AY920361)或DHRS4L2-900a(KC237374)进一步表明DHRS4L2-Ea抑制CPNE6表达的作用.定量PCR结果显示si-RNA抑制DHRS4L2-Ea表达使CPNE6 mRNA表达上调.亚硫酸盐测序结果显示在SK-N-SH转染DHRS4L2-800a(AY920361)的样本中CPNE6基因DNA CpG甲基化增加.综上所述,本研究揭示DHRS4L2表达的非编码RNA抑制其下游基因CPNE6的表达.

正常肝和肝癌细胞中DHRS4L2基因选择性剪接亚型的克隆及其表达调控研究

目的:鉴定正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞Hep-G2中DHRS4L2基因的选择性剪接新亚型,并探讨其表达调控机制。方法:应用RT-PCR,3′RACE和生物信息学方法发现并鉴定DHRS4L2基因的选择性剪接新亚型;去甲基化药物5-aza-dC处理HL-7702和Hep-G2细胞,通过RT-PCR和real-time PCR方法检测DHRS4L2的表达情况。结果:发现了2个新的DHRS4L2剪接亚型DHRS4L2A和DHRS4L2A3,2个新亚型均出现了新的第1个外显子,命名为Ea,前者缺失外显子1,后者缺失外显子1和3;在正常肝细胞中去甲基化后含DHRS4L2外显子1的转录产物比处理前明显增加,在肝癌细胞中则比处理前减少。结论:获得2个新的DHRS4L2剪接亚型,并发现DHRS4L2的表达和甲基化调控相关,且甲基化的调控作用在正常肝与肝癌细胞之间存在差异,其机制尚待进一步探讨。

神经母细胞瘤SK-N-SH细胞内DHRS4L2基因一种新选择性剪接亚型S4的克隆和亚细胞定位

目的 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系脱氢酶/还原酶（SDR家族）成员4类2[dehydrogenase/reductase（SDR family）member 4 like 2,DHRS4L2]基因的一种新的选择性剪接亚型克隆、生物信息学分析及其亚细胞定位.方法 以SK-N-SH细胞cDNA为模板,PCR扩增DHRS4基因簇Ea1转录本.将PCR产物A-T克隆至pGEMT-Easy质粒,对质粒进行DNA Sanger测序.将测序所得序列用NCBI ORF finder分析其编码区,用Motif Scan分析预测蛋白氨基酸序列.用Clustal Omega进行蛋白序列比对分析.将新亚型完整编码框cDNA以及删除偶核定位信号的编码框分别插入pEGFP-C1质粒,所得质粒和空质粒分别转染SK-N-SH细胞,在荧光显微镜下观察转染表达蛋白亚细胞定位.结果 用RT-PCR和Sanger测序方法发现,SK-N-SH表达DHRS4L2 Ea1转录本,未检测到其表达脱氢酶/还原酶（SDR家族）成员4类1[dehydrogenase/reductase（SDR family）member 4 like 1,DHRS4L1]的Ea2转录本.DHRS4L2 Ea1表达一个新的选择性剪接亚型DHRS4L2-S4（KU141377）,由AY616183基础上在Ea1与E2外显子之间插入新外显子Ej形成,外显子Ej含有新亚型翻译起始密码子ATG.转录本KU141377预测蛋白羧基端具有偶核定位信号（bipartite nuclear localization signal,NLS）,提示其可能定位于细胞核.绿色荧光蛋白融合蛋白实验显示,在SK-N-SH细胞该蛋白定位于细胞核.该蛋白还含有一个甘氨酸密集区（glycine-rich region）和阿片样生长因子受体重复（opioid growth factor receptor repeat）序列.结论 研究发现SK-N-SH细胞表达的一种DHRS4L2新选择性剪接亚型KU141377,其预测编码蛋白含有细胞偶核定位信号,融合荧光蛋白实验显示该新亚型定位于细胞核,这为后续研究DHRS4L2在神经母细胞瘤中的潜在功能奠定基础.